非洲鸵鸟源乳酸菌的生物学特性研究

孙 卿，王家乡，李 鹏，谢 洋，周诗钦，吴 艳

（1.长江大学动物科学学院，湖北荆州 434025；2.西南大学动物科学技术学院，重庆 400715；3.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，武汉 430064）

非洲鸵鸟（Struthio camelus）生活于非洲，食物以植物的茎、叶、果实等为主，其胃肠道［1，2］消化能力十分出众，其肠道菌群具有特殊研究意义。乳酸菌作为常见的益生菌，研究其生物学特性，对鸵鸟源乳酸菌制剂的制备具有重要意义。本研究以健康成年非洲鸵鸟为试验对象，采集其新鲜粪便进行乳酸菌的分离、鉴定，对分离得到的3株菌株进行生长曲线及菌液pH测定、酸和胆盐耐受性试验以及药物敏感性试验，在生物学特性研究基础上进行筛选，以期获得性能优良的菌株，为乳酸菌进一步的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从非洲鸵鸟新鲜粪便中分离鉴定出的3株乳酸菌M1、M2、M3。

1.2 试剂与仪器

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、吐温-80、磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸二铵、硫酸镁、硫酸锰、琼脂、猪胆盐、pH试纸（上海三爱思试剂有限公司）；链霉素药敏片（10μg/片）、卡那霉素药敏片（30μg/片）、庆大霉素药敏片（10μg/片）、四环素药敏片（30μg/片）、氧氟沙星药敏片（5μg/片）（杭州微生物试剂有限公司）。

二氧化碳培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；恒温振荡培养箱（SK902，恒丰医疗器械有限公司）；冰箱（海尔集团）；电子天平（PGC2531，埃德姆衡器有限公司）；pH检测仪（常州亿通分析仪器制造有限公司）；石英比色皿、可见分光光度仪（上海光谱仪器有限公司）；灭菌锅（上海博迅实业有限公司）；漩涡混合器（XW-80A，上海泸西分析仪器厂有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 生长曲线及产酸曲线测定

1）生长曲线：将菌种在液体MRS中接种培养，每2 h取样，利用分光光度仪于600 nm处测定吸光度（A600nm），绘制生长曲线。

2）产酸曲线：方法同上，每2 h取样，通过pH检测仪测定pH，绘制菌株产酸曲线。

1.3.2 抗逆性试验

1）耐酸试验：将菌株按5%接种量接入至pH 3的MRS液体培养基中，同时以pH 7的MRS液体培养基为对照组，培养3 h后用PBS溶液倍比稀释，涂板计数，每组重复3次。

2）耐胆盐试验：将菌株按1%接种量接入到分别含有0、0.1%、0.3%和0.5%猪胆盐的MRS液体培养基中，培养12 h，测定其A600nm，每组重复3次。

1.3.3 药物敏感性试验取50μL发酵菌液涂布于MRS固体培养基上，用干净无菌的镊子夹起药敏纸片（氧氟沙星、链霉素、卡那霉素、四环素、庆大霉素）放在培养基表面轻轻按压，37℃厌氧培养24 h，依据药敏片判定标准判定细菌的药物敏感性。

2 结果与分析

2.1 生长曲线及产酸曲线

对菌株的生长繁殖以及产酸情况进行测定。如图1所示，M1、M2、M3生长曲线基本一致，呈S形，0～6 h生长缓慢，为迟缓期，6～12 h内生长最快，进入对数生长期，14 h后进入平缓期。如图2所示，M1、M2、M3产酸能力也是基本一致，菌液pH不断降低，其中M1最低点为4.95，M2最低点为4.93，M3最低点为4.92。在0～6 h之内，菌液pH变化不明显，表明生长迟缓。6～14 h之内菌液pH下降较快，表明进入对数生长期，生长代谢加快。14 h后稳定，生长代谢缓慢。

图1 菌株生长曲线

图2 菌株产酸曲线

2.2 耐酸试验

如图3所示，在pH 3的酸性环境中，培养3 h后用PBS溶液倍比稀释，涂板计数发现M1菌株活菌浓度高于1×109CFU/mL，M2菌株活菌浓度约为1×107CFU/mL，M3菌株活菌浓度约为1×103CFU/mL，表明在pH 3的酸性环境中，M1的耐酸能力最强，M2的耐酸能力次之，M3的耐酸能力最差。

图3 菌株耐酸能力

2.3 耐胆盐试验

如图4所示，菌液培养12 h后测定其A600nm，表明在0.1%的猪胆盐条件下，3株菌正常生长；在0.3%的猪胆盐条件下，M1菌株生长受到抑制，而M2、M3生长情况依然良好；在0.5%的猪胆盐条件下，3株菌生长均受到抑制。

图4 菌株耐胆盐能力

2.4 药物敏感性试验

如表1所示，经37℃厌氧培养24 h后，M1、M2、M3菌株对链霉素、卡那霉素、庆大霉素中度敏感，对四环素、氧氟沙星耐药。

表1 药物敏感性试验结果

3 小结与讨论

由于畜产品中药物残留和病原菌耐药性增强等问题，例如不规范用药造成的药物残留、耐药菌增多等，严重阻碍养殖业的健康发展并且损害人类健康。越来越多的国家开始重视无残留和无污染的发酵产品，研究人员也正在寻找无毒无害的替代品，减少药物危害。微生态制剂是一种可以替代抗生素的优良产品。乳酸菌是一种重要的益生菌［3-5］，能发挥出良好的益生性，十分适合代替抗生素。动物源乳酸菌是天然理想的益生乳酸菌，其制剂可以降低机体胆固醇含量［6，7］、抗肿瘤、降血压、改善糖尿病、抗氧化。其不仅可以提高免疫能力［8］，保护畜禽机体健康，产生抑菌物质，抑制肠道病原菌繁殖，还能够减少药物的使用。已有研究表明，为使乳酸菌制剂在动物机体内产生效果，乳酸菌制剂需要保证其生长速度与动物进食后饲料在胃肠道内的消化时间同步［9］，同时也要保证自身对胆盐存在一定的耐受性［10］。除此以外，乳酸菌的药物敏感性也有重要意义。益生菌与抗生素药物配合使用能够有效提高动物的生产能力［11］，但是抗生素在抑制有害菌生长的同时，也会杀死其他细菌［12］，从而减少益生菌的数量，影响机体的生态平衡。因为抗生素无法识别有害菌以及益生菌，所以只有提高益生菌的耐药性，才能抵抗抗生素的侵袭，减少抗生素对机体的损害，并且减少细菌的耐药性，从而产生理想的效果。

本试验研究了3株非洲鸵鸟粪便中乳酸菌的生长规律以及产酸性能，发现3株乳酸菌接种6～12 h后进入对数生长期，14 h后进入平缓期。菌液pH 10～14 h时下降较快，表明此时进入对数生长期，生长代谢加快。18 h后稳定，生长代谢缓慢。在抗逆方面，3株乳酸菌的耐酸和耐胆盐能力，发现在pH3的酸性环境中，M1的菌株耐酸能力比M2、M3菌株强；在0.1%的猪胆盐条件下，3株乳酸菌正常生长，在0.3%的猪胆盐条件下，M2、M3菌株的耐胆盐能力比M1菌株强，但是在0.5%的猪胆盐条件下，3株菌生长均受到抑制。在药物敏感方面，3株菌株对链霉素、卡那霉素、庆大霉素中度敏感，对四环素、氧氟沙星耐药。