RANK基因2个SNP位点多态性与贵州燃煤污染型地氟病患病风险的相关性*

赵安宿， 田薇， 李瑞超， 喻艳琴， 王婵娟， 张婷， 吴昌学*， 何燕*

(贵州医科大学 地方病与少数民族疾病教育部重点实验室 & 贵州省医学分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳 550004)

氟是一种常见的微量元素,参与人体生命活动的调节，人体每日摄入适量的氟,可促进牙齿和骨骼的发育,预防龋齿[1]；但是氟过量也会导致人体中毒,严重者甚至会对人的生命健康造成威胁，产生以骨骼病变为主的地方性疾病[2-3]。根据氟化物的来源，地方性氟中毒分为饮水型氟中毒、饮茶型氟中毒、燃煤污染型氟中毒[4-6]，其中燃煤污染型地方性氟中毒(简称燃煤型地氟病)是由于居民长期在室内使用高氟煤取暖、烘烤食物，导致人体氟摄入过量引发的全身性慢性疾病[7]。研究发现，氟具有很强的亲骨性，适量氟能促进骨骼发育，但过量氟摄入会影响骨形成与骨吸收，引发骨代谢紊乱导致氟骨症，主要表现为关节僵直、腰腿关节疼痛、骨骼变形等症状[8-10]。近年来的研究发现，氟对骨骼的毒性作用机制复杂，除外界因素的刺激外，还可能受遗传因素的影响[11]。流行病学调查发现，不同的人群对于氟暴露反应敏感性不同，氟骨症的发病率存在差异[12]，提示遗传因素可能与氟中毒的发病机制有关。RANK属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)超家族成员之一，是一种Ⅰ型跨膜蛋白，由616个氨基酸残基组成，基因定位于染色体18q21.33，全长3 809 bp，外显子12个。RANK与核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)结合能引起破骨细胞分化成熟[13]。有研究报道RANK基因多态性与某些骨疾病有关系，Wang等[13]报道了RANK基因rs1805034位点CC基因型与骨关节炎的发生相关，Chen等[14]发现RANK基因rs884205基因多态性与肱骨头坏死有关。但RANK基因的rs1805034和rs884205位点多态性与燃煤型地氟病的反生发展是否相关的报道较少。本研究在知情同意的原则下，以贵州省某燃煤污染型地氟病人群为调查对象，探讨该人群外周血DNA中RANK基因的rs1805034和rs884205位点多态性与燃煤污染型地氟病患病的关系，报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择居住于贵州省六枝特区梭戛苗族彝族回族乡(简称梭戛乡)3年及以上、无颅脑外伤及精神疾病家族史的8～12岁在校小学生作为研究对象，在知情同意原则下，根据《氟斑牙诊断标准》(WS/T 208-2011)进行氟斑牙分度诊断，其中氟斑牙分度在极轻度及以上者为地氟组，分度正常者为对照组。入选人数：地氟组283人，平均年龄(10.32±1.46)岁，男139人、女144人；对照组200人，平均年龄9.89±1.31岁，男101人、女99人。

1.2 研究方法

1.2.1DNA模板标化 采集研究对象外周静脉血5 mL，采用DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取全血基因组DNA，用NanoDrop Lite紫外分光光度计[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]对DNA定量后，标化至30 mg/L，转入96孔PCR反应板中作为模板DNA，封膜后-20 ℃保存备用。

1.2.2基因分型 采用TaqMan-MGB探针法对RANK基因rs1805034和rs884205位点进行基因分型。PCR反应总体系(10 μL)：TaqMan genotyping Master MixⅡ 3.0 μL，探针0.15 μL，DNA溶液(3 mg/L)1.0 μL，加无菌ddH2O补足至10 μL。PCR反应条件：60 ℃ 30 s，95 ℃预变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循环40次；60 ℃ 30 s结束反应。采用Step one software v2.3软件分析扩增结果。

1.2.3测序验证 根据分型结果，每个SNP位点、每种基因型随机抽取5%的样本送生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证(不足5例的全部测序验证)，测序结果与分型结果100%相符。测序引物序列见表1。

1.3 统计学分析

采用χ2检验对两组样本两个 SNP位点基因型频率进行Hardy-Weinberg平衡检测， SPSS 22.0 统计软件分析各SNP位点的等位基因、基因型频率在各组间的分布差异；采用SNPstats对每个SNP位点基因型与燃煤型地氟病发生发展的相关遗传模式进行分析，并根据赤池信息量准则(akaike information criterion，AIC)和贝叶斯信息准则(bayesian information criterions，BIC)来确定最优遗传模式；采用在线软件系统SHEsis对RANK基因rs1805034和rs884205位点之间进行连锁不平衡分析，各个方块的颜色由浅至深表连锁程度由低到高。D′代表连锁不平衡系数，颜色越深、D′值越大，代表两位点之间连锁不平衡越强；当D′>0.5时存在弱连锁不平衡，D′> 0.8、且r2> 0.3时两点间存在强连锁不平衡，D′=1 存在完全连锁不平衡；r2为相关系数。

2 结果

2.1 基因分型

研究采用Step One Software v2. 3软件对 Real-time PCR 扩增分析，结果显示RANK基因 rs1805034 位点在地氟病人群和对照组人群中均存在C和T等位基因以及3种基因型(即CC、CT、TT)，如图1；rs884205位点在地氟病人群和对照组人群中均存在A和C等位基因以及3种基因型(即AA、 AC、CC )。见图2。

注：红点为CC野生型，绿点为CT杂合型，蓝点为TT突变纯合型，“X”为未确定。图1 RANK基因rs1805034位点基因分型Fig.1 rs1805034 loci genotyping of RANK gene

注：红点为CC野生型，绿点为AT杂合型，蓝点为AA突变纯合型，“X”为未确定。图2 RANK基因rs884205位点基因分型Fig.2 rs884205 locus genotyping of RANK gene

2.2 测序验证

随机在每个SNP位点的每种基因型样本中抽样5%进行测序验证，例数不足5例的全部测序，测序结果与基因分型结果完全符合。见图3、图4。

图3 RANK基因 rs1805034位点测序结果Fig.3 Sequencing of rs1805034 of RANK gene

图4 RANK基因 rs884205 位点测序结果Fig.4 Sequencing of rs884205 of RANK gene

2.3 rs1805034和rs884205等位基因及基因分型的分布频率

rs1805034和rs884205位点的基因型频率在地氟组和对照组中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡。在地氟组和对照组间两个位点的等位基因及基因分型比较显示：RANK基因rs1805034位点等位基因和基因型分布在地氟组和对照组之间差异有统计学意义(P<0.05)，rs884205位点基因型和等位基因分布在地氟组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 RANK基因多态性位点在地氟组和对照组中的分布频率Tab.2 Distribution frequency of RANK gene polymorphism loci in the fluorosis group and control group

2.4 贵州梭戛RANK基因rs1805034和rs884205位点最优遗传模式分析

采用 SNPStats 在线软件对地氟组和对照组的RANK基因 rs1805034 位点和rs884205位点的等位基因进行最优遗传模式分析， 探讨2个多态性位点基因型与燃煤型地氟病发生的相关性。结果显示RANK基因rs1805034位点最优遗传模式为共显性，在该遗传模式下C/T基因型和T/T基因型相对于C/C基因型来说是燃煤型地氟病发生的保护因素(OR=0.17，95%CI为0.09～0.31；OR=0.04，95%CI为0.02～0.08)；rs884205位点与燃煤型地氟病的发生无相关性(P>0.05)。见表3。

表3 地氟组和对照组最优遗传模式分析Tab.3 Analysis of optimal genetic model between fluorosis group and control group

2.5 贵州梭戛RANK基因rs1805034和rs884205位点在地氟组和对照组间连锁不平衡分析

SHEsis分析结果显示RANK基因多态性位点之间不存在连锁不平衡(D′<0.5)。见图5。

图5 地氟组和对照组间2个多态性位点的连锁不平衡分析Fig.5 Analysis of linkage disequilibrium of 2 polymorphism loci between fluorosis group and control group

3 讨论

氟参与人体生命活动的调节，适量的氟不仅对牙齿和骨骼的发育有好处而且还可以预防龋齿[15]。但在牙齿和骨骼发育过程中氟的过量摄入可能会影响牙釉质的发展、导致骨稳态的紊乱，导致牙釉质缺失、骨骼氟中毒等症状，引起骨转换障碍，导致各种骨骼病变，如骨硬化、骨质疏松和退行性关节改变[16]。氟中毒有急性和慢性氟中毒之分。慢性氟中毒比较常见，分为饮水、饮茶和燃煤污染型,其临床特征均为氟斑牙和氟骨症[17-18]。高氟刺激下，成骨细胞大量分泌骨钙素，可参与骨代谢并调节相关激素表达水平，从而影响骨质生长发育、骨骼和非骨骼系统[19-20]。地氟病的发病机制和治疗策略尚未阐明。随着分子生物学技术的发展，对地氟病的发病机制进入了分子水平研究。

RANK基因对骨的形成和发育具有重要作用，其上SNP位点多态性与骨相关疾病的研究近年来屡见报道，Casas-Avila等[21]报道了RANK基因rs3018362位点多态性与骨质疏松症具有相关性，Mohamed等[22]报道了RANK基因rs1805034位点多态性与绝经后妇女骨质疏松症的发生有关。在本研究中对RANK基因rs1805034、rs884205位点进行多态性分型结果显示，RANK基因rs1805034位点基因型在地氟组的分布为CC频率42.8%、CT频率46.6%、TT频率10.6%，在对照组的分布为CC 频率8.0%、CT频率 46.0%、TT 频率46.0%，差异有统计学意义(P<0.05)；等位基因在疾病组的分布为C 频率66.1%、T 频率33.9%，在对照组的分布为C频率 31.0%、T频率 69.0%，差异有统计学意义(P<0.05)；rs884205位点基因型和等位基因在地氟组和对照组之间分布差异无统计学意义(P>0.05)。最优遗传模式分析RANK基因2个SNPs位点多态性与燃煤型地氟病发生的相关性，结果显示RANK基因rs1805034位点最优遗传模式为共显性，在该遗传模式下C/T基因型和T/T基因型相对于C/C基因型来说是燃煤型地氟病发生的保护因素(OR=0.17，95%CI为0.09～0.31；OR=0.04，95%CI为0.02～0.08)，其余位点与燃煤型地氟病的发生无相关性(P>0.05)，提示rs1805034位点C/T基因型和T/T基因型可能与燃煤型地氟病的发生有相关性。本研究对RANK基因多态性位点在地氟组和对照组中进行连锁不平衡分析结果显示，RANK基因上述2个多态性位点之间不存在连锁不平衡(D′<0.5)，不能构建单倍型，因此无法通过连锁不平衡来判断RANK基因上述2个多态性位与燃煤型地氟病的关系。

综上所述，本研究显示RANK基因rs1805035位点可能与燃煤型地氟病的发生有关，rs884205可能与燃煤型地氟病的发生无关。由于本研究样本量相对较少，容易产生统计偏差，还需进一步加大样本量开展研究工作，从而阐述RANK基因 rs1805035、rs884205位点与燃煤型地氟病的相关性。