NLRP3炎症小体对腹膜透析相关性腹膜纤维化的作用*

刘谊蓉， 黄振兴

(西宁市第一人民医院 肾内科， 青海 西宁 810000)

腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是公认的终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)患者的肾脏替代疗法，PD依靠腹膜(peritoneal membrane，PM)作为超滤和扩散的半透屏障[1-2]。目前，全球约有11%的ESRD患者使用PD[3]。长期PD导致PM间质形态和功能的改变，被定义为PM纤维化(peritoneal fibrosis，PF)，是PM超滤失败的主要原因[4]。尿毒症、生物不相容的PD溶液及PM炎症是PF的已知诱因，PM炎症是PF发展过程中的关键事件[5-6]。研究报道核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体参与了心血管和肾脏疾病的无菌炎症反应[7]。此外，NLRP3本身也被认为参与了肾小管上皮细胞转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的信号转导，并促进了肾纤维化[8]。Hautem等[9]报道NLRP3炎症小体在PD相关细菌性PM炎的运输缺陷和形态改变中起作用。但NLRP3炎性小体在PD相关PF中的作用仍需进一步研究。因此，本研究旨在探讨NLRP3炎性小体在PD相关PF发生中的作用，为研究PD相关PF的发病机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1大鼠和细胞来源 选用健康SD大鼠24只，体质量180～200 g，购自成都达硕实验动物有限公司[许可证号SCXK(川)2019-189]，饲养于室温(24±2)℃的环境中，维持光-暗12 h循环交替，予以充足的食料和洁净饮水；人PM间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells，HPMC)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.1.2主要试剂及仪器 1.5%、2.5%、4.25%PD液(PD solution，PDS；美国Baxter医疗)，Dulbecco's modified eagle medium(DEME)培养基(美国Gibco)，胎牛血清(美国Hyclone)，胰酶(上海碧云天生物)，苏木素染液、伊红染液(珠海贝索生物)，柠檬酸铅染液(北京中镜科仪)，四氧化锇(上海摩贝生物)，RNA Trizol Reagent(合肥博美生物)，TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(北京宝日医生物)，相关一抗NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)、半胱氨酸蛋白酶-1(cysteine aspartate-specific protease-1，Caspase-1)、转化生长因子β1(transforming growth factor- pr，TGF-β1)及白细胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β；美国Cell Signaling Technology)，生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(英国Abcam)；Western细胞裂解液和二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物)，增强化学发光法(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂盒(美国Affinity)；JEM-1400PLUS透射电子显微镜(日本JEOL)，PIKORed 96实时荧光定量(real-time fluorescence quantification，RT-PCR)仪(美国Thermo Fisher)，化学发光凝胶成像仪5200(上海天能科技)。

1.2 研究方法

1.2.1细胞培养 HPMC细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃的5%CO2培养箱内培养，待细胞长至80%融合时胰酶消化，采用血细胞计数板进行细胞计数，调整细胞密度约 0.5×102个/L接种于6孔板中，37 ℃的5%CO2恒温培养箱中静置培养，待细胞长至80%时待用。

1.2.2细胞鉴定 采用免疫荧光染色对HPMC细胞进行鉴定。在培养板中将已爬好细胞的玻片用磷酸缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)浸洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗3次，滴加正常山羊血清，室温封闭30 min，滴加足够量的稀释好的抗波形蛋白抗体(vimentin，Vim)，放入湿盒，4 ℃孵育过夜；PBST浸洗爬片3次，滴加稀释好的荧光(Cy3)标记羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育1 h，加血清封闭30 min，滴加稀释好的抗细胞角蛋白抗体(pan cytokeratin，PCK)，4 ℃孵育过夜；PBST 浸洗爬片3次，滴加稀释好的荧光异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记羊抗兔 IgG，37 ℃孵育1 h；滴加4,6-联脒-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)避光孵育5 min，对标本进行染核；后用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，于荧光显微镜下观察采集图像。

1.2.3细胞分组 取对数期生长HPMC细胞分为HPMC组(不予以任何处理)、1.50%PDS组(1.50%PDS1.5 mL)、2.50%PDS组(2.50%PDS1.5 mL)、4.25%PDS组(4.25%PDS1.5 mL)、NC-siRNA组(转染NC-siRNA)、siRNA-NLRP3组(转染siRNA-NLRP3)、siRNA-NLRP3+4.25%PDS组(转染siRNA-NLRP3+4.25%PDS1.5 mL)。1.50%PDS组、2.50%PDS组及4.25%PDS组HPMC细胞分别于1.50%、2.50%及4.25%PDS中培养24 h，NC-siRNA组、siRNA-NLRP3组及siRNA-NLRP3+4.25%PDS组细胞分别采用Lipofectamine®2000按制造商说明用转染NC-siRNA或siRNA-NLRP3或加4.25%PDS，24 h后收集细胞进行后续分析。

1.2.4透射电镜观察 取1.2.3项下各组HPMC细胞经3%戊二醛预固定，1%四氧化锇再固定，丙酮脱水，将脱完水的细胞先后经脱水剂和环氧树脂渗透液，比例分别为3 ∶1、1 ∶1、1 ∶3，30～60 min/步；将渗透好的HPMC细胞块放于适当模具中，包埋液包埋，加温聚合形成固体基质(包埋块)；采用超薄切片机制备约50 nm厚的超薄切片，醋酸铀、枸橼酸铅先后染色，室温下染色15～20 min，透射电镜观察细胞形态。

1.2.5大鼠PF模型构建及取样 大鼠适应性饲养1周，随机均分为生理盐水组、1.50%PDS组、2.50%PDS组及4.25%PDS组，每组6只，各组均按100 mL/(kg·d)处理，连续6周；全程给予普通饲料喂养，自由进水；4.25%PDS组大鼠死亡1只，其余组无死亡；各组大鼠末次干预后，采用1%戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，采集各组大鼠PM组织，取70%PM组织置于-20 ℃低温保存、30%PM组织采用4%多聚甲醛溶液固定，用于后续实验。

1.2.6苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色 取1.2.5项下各组大鼠PM组织，石蜡包埋，连续切片，厚度5 μm，HE染色，二甲苯透明，中性树胶封固，镜检观察各组大鼠PM组织的病理学特征。

1.2.7实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测 取1.2.5项下各组大鼠PM组织，使用TRIzol试剂盒按照制造商说明从PM组织中提取总RNA，逆转录合成cDNA，定量基因表达水平。引物序列：NLRP3 正向为5′-AAGAAGAGGAGGAAGTTA-3′，反向为5′-GTCAGATAGTTCAACAAT-3′；TGF-β1 正向为5′-TTAAGCAGCAGAGAC

GACCG-3′，反向为5′-TCACCGGGAACTCTATAGGT-3′；IL-1β正向为5′-GAATCTATACCTGTCTTGTG-3′，反向为5′-TTGAGAAGTGCTGATGTA-3′；GADPH正向为5′-ATCCCATCACCATCTTCCCAG-3′，反向为5′-CCATCACGCCAGTTTTCC-3′。以GAPDH内参。qRT-PCR反应条件为95 ℃初始变性10 min，95 ℃变性10 s、60 ℃退火10 s、72 ℃延伸10 s、45个循环；记录Ct值，采用2-ΔΔCt分析NLRP3、TGF-β1、IL-1βmRNA的相对表达水平。

1.2.8免疫印迹法(Western blot)检测 取1.2.3项下各组HPMC细胞及1.2.5项下各组大鼠PM组织，检测HPMC组、1.50%PDS组、2.50%PDS组HPMC细胞及各组大鼠PM组织中NLRP3和TGF-β1蛋白表达，检测NC-siRNA组、4.25%PDS组、siRNA-NLRP3组及siRNA-NLRP3+4.25%PDS组HPMC细胞中NLRP3、ASC、Caspase-1、TGF-β1及IL-1β蛋白表达。采用RIPA裂解缓冲液从各组HPMC细胞和PM组织中提取蛋白质，冰上孵育，12 000 r/min离心5 min，收集上清液，用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度；上清液与十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)样品加载缓冲液混合，转移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，5%脱脂牛奶中室温封闭2 h，将膜与抗NLRP3(1 ∶500)、ASC(1 ∶500)、Caspase-1(1 ∶500)、TGF-β1(1 ∶500)、IL-1β(1 ∶500)或β-actin(1 ∶2 500)的一抗一起于4 ℃孵育过夜；与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)偶联的二抗(1 ∶3 000)孵育1 h；ECL暗室显色，使用Bio-Rad全功能成像系统采集图像，Image-ProPlus分析光密度，以β-actin为内参，对照组目标蛋白质相对含量为1，计算蛋白质的相对表达量，实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 PM组织病理学特征

生理盐水组大鼠PM组织结构较为完整、清晰，未见明显增厚；1.50%PDS组大鼠PM组织轻微增厚，间皮细胞排列紊乱甚至缺失，少量纤维组织增生，PM下肌束结构清晰，肌细胞排列较为整齐，未见明显变性坏死或炎细胞浸润；2.50%PDS组大鼠PM组织增厚，纤维组织增生较为明显，间皮细胞基本消失不见，局部可见少量淋巴细胞或中性粒细胞散在分布，PM下肌束结构清晰，肌细胞排列较为整齐，未见明显变性坏死或炎细胞浸润；4.25%PDS组大鼠PM组织明显增厚，间皮细胞基本消失不见，大量纤维组织增生，增生纤维组织较为致密，增生区域炎细胞浸润，以淋巴细胞和中性粒细胞为主，局部区域可见少量血管增生。见图1。

图1 各组大鼠PM组织学特征(HE染色)Fig.1 Histological characteristics of rat PM tissues in each group (HE staining)

2.2 PM组织NLRP3炎症小体的表达

与生理盐水组比较，4.25%PDS组大鼠PM组织NLRP3、TGF-β1及IL-1βmRNA表达增加(P<0.05)，2.50%PDS组大鼠PM组织NLRP3和TGF-β1 mRNA表达增加(P<0.05)、但IL-1βmRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)，1.50%PDS 组大鼠PM组织NLRP3、TGF-β1及IL-1βmRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)；与生理盐水组比较，4.25%PDS组和2.50%PDS组大鼠PM组织NLRP3、TGF-β1蛋白表达增加(P<0.05)，1.50%PDS 组NLRP3、TGF-β1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

注：A为mRNA表达定量结果，B、C分别为蛋白条带检测结果及其灰度值定量结果；(1)与生理盐水组比较，P<0.05。图2 各组大鼠PM组织NLRP3炎症小体的表达Fig.2 Expression levels of NLRP3 inflammasome in rat PM tissues in each group

2.3 各组HPMC细胞中NLRP3炎症小体的表达

细胞鉴定结果显示，Vimentin (红色荧光)和PCK(绿色荧光)双阳性率>90%，即细胞纯度>90%；电镜观察结果显示HPMC组HPMC细胞形态结构较正常、细胞核呈不规则多边形、染色质分布均匀、以常染色质为主且核膜完整，1.50%PDS组和2.50%PDS组HPMC细胞核呈不规则多边形、染色质分布均匀、以常染色质为主、胞浆中可见细胞器(线粒体、粗面内质网、高尔基体和核糖体等)且结构完整清晰且可见少量自噬，4.25%PDS组HPMC细胞核膜完整、细胞器结构完整清晰、细胞中积累了与自噬相关的结构和凋亡空泡；Western blot检测结果显示，与HPMC组比较，2.50%PDS组和4.25%PDS组HPMC细胞NLRP3和TGF-β1蛋白表达明显升高(P<0.01)。见图3。

注：A为细胞鉴定结果(红色荧光为Vim阳性，绿色荧光为PCK阳性；DAPI是细胞核染料，Merge为DAPI和免疫荧光染色的融合图；200×)，B为电镜观察结果(6 000×)，C、D分别为蛋白条带检测结果及其灰度值定量结果；(1)与HPMC组比较，P<0.05。图3 各组HPMC细胞NLRP3炎症小体的表达Fig.3 Expression levels of NLRP3 inflammasome in HPMC cells in each group

2.4 细胞PF和NLRP3炎症小体的表达

电镜观察结果显示，NC-siRNA组、4.25%PDS组、siRNA-NLRP3组及siRNA-NLRP3+4.25%PDS组HPMC细胞细胞器形态结构都较完整，但4.25%PDS组HPMC细胞胞浆中含大量空泡；除NC-siRNA组外，其余3组HPMC细胞均存在不同程度的自噬，siRNA-NLRP3+4.25%PDS组HPMC细胞自噬程度减轻(图4A)。Western blot检测结果显示与NC-siRNA组比较，4.25%PDS组HPMC细胞NLRP3、ASC、Caspase-1、TGF-β1及IL-1β蛋白表达升高(P<0.05)；与4.25%PDS组比较，siRNA-NLRP3+4.25%PDS组HPMC细胞中NLRP3、ASC、Caspase-1及TGF-β1蛋白表达降低(P<0.05，图4B和图4C)。

注：A为电镜观察结果(6 000×)，B、C分别为蛋白条带检测结果及其灰度值定量结果；(1)与NC-siRNA组比较，P<0.05；(2)与4.25%PDS组比较，P<0.05。图4 NLRP3对细胞PF和NLRP3炎症小体表达的影响Fig.4 Effect of NLRP3 expression on cellular PF and NLRP3 inflammasome expression

3 讨论

在长时间的PD过程中，高糖PDS会加重PF，导致PD效果降低和超滤失败，目前PD相关PF的机制仍有待阐明[10]。有研究显示影响PD治疗的关键因素是PM结构和功能的改变，长期PD患者的PM组织伴随PF的形成，在患者发生严重或反复发生PM炎时更加明显，而反复发生的PM炎是导致人PM间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells，HPMCs)发生上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的主要原因，最终导致超滤衰竭使患者透析终止[11]。此外，有研究显示NLRP3炎症小体在介导组织损伤引起的无菌性炎症中起重要作用，NLRP3是核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族成员，可募集ASC及Caspase-1组成多蛋白复合体-NLRP3炎症小体，由于Caspase-1是一种IL-1β转换酶，NLRP3炎症小体激活Caspase-1，Caspase-1进而诱导IL-1β前体进入成熟状态，进而导致组织炎症和损伤[12-16]。体外研究发现，IL-1β可呈剂量依赖性地诱导肾小管等发生 EMT，PDS可呈时间和剂量依赖性活化HPMCs的NLRP3，诱导HPMCs发生 EMT，将si-NLRP3转染至HPMCs发现可部分抑制含糖PD液诱导的PF[17]。此外，NLRP3炎症小体的激活也会触发炎症细胞死亡[18]。有研究表明，NLRP3炎症小体是包括痛风、动脉粥样硬化、2型糖尿病及代谢综合征等多种疾病的关键介质，且可参与纤维化因子的表达和组织纤维化的发展[19-22]。PDS诱导PF大鼠模型显示了PD相关性PF的一些组织学特征，所以适合于研究PD相关性PF的发病机制[23]。本研究采用不同浓度PDS诱导大鼠PF，结果显示4.25%PDS可明显导致PM组织损伤，增加NLRP3和TGF-β1蛋白表达。这一结果与Hautem等[9]研究一致。HPMC是PM结构的主要组成部分，因此HPMCs的细胞功能水平对透析充分性起着关键作用[24]。本研究采用不同浓度PDS干预HPMC，发现4.25%PDS处理后细胞中积累了与自噬相关的结构和凋亡空泡，并较HPMC组NLRP3、TGF-β1蛋白表达明显升高，而NLRP3抑制可以减轻细胞自噬程度及明显降低NLRP3、ASC、Caspase-1及TGF-β1蛋白表达，提示NLRP3炎性小体参与了PD相关性PF的过程，抑制NLRP3可减轻HPMC自噬程度。虽然本研究已表明抑制NLRP3可减轻PDS诱导的PF细胞自噬，但其机制仍有待阐明。最近有研究表明，NLRP3炎性小体的激活通过裂解Gasdermin D诱导了一种特殊形式的细胞死亡，称为细胞焦亡[25-26]；另一方面ASC还参与了其他类型的细胞死亡，如Caspase-8介导的凋亡或坏死[27]。因此，需要进一步研究NLRP3炎症小体在PD相关PF中的确切机制和作用。

综上所述，本研究表明NLRP3炎症小体在PD相关PF中有着重要作用，提示NLRP3炎症小体是预防和治疗PD相关PF的潜在靶点，但NLRP3炎症小体的确切机制仍需进一步研究。