糖通饮对2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠肝组织的保护作用及机制*

陈俞如， 马欢， 伏红颖， 潘艳伶,2***

(1.贵州医科大学 临床医学院 中医学教研室， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学附属医院 中医科， 贵州 贵阳 550004)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者中极为普遍，T2DM患者罹患NAFLD的几率可达60%左右[1]，如未能及时治疗，可导致肝硬化、肝纤维化、肝癌及心血管疾病的发生[2]，因此对T2DM合并NAFLD引发的肝损伤进行积极防治意义重大。本课题组前期研究中发现名老中医经验方糖通饮可改善T2DM大鼠胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)并能显著降低其血脂水平[3-5]，但糖通饮对T2DM合并NAFLD模型大鼠肝组织是否具有保护作用尚不清楚。因此，本研究通过对T2DM合并NAFLD模型大鼠进行糖通饮干预治疗后，观察各组大鼠相关指标的变化，从而探讨糖通饮对T2DM合并非酒精性脂肪肝模型大鼠肝组织的作用及可能机制，为临床应用该方治疗T2DM合并NAFLD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 44只SPF级SD雄性大鼠，体质量(180±20)g，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供，许可证号SCXK(军)2012-0011，大鼠置于贵州医科大学临床医学实验中心动物房饲养，自由摄水饮食，饲养温度21～26 ℃。

1.1.2药物与试剂 糖通饮(生地、黄芪、山药、山茱萸、茯苓、丹皮、丹参、草决明、泽泻、地骨皮)由贵州医科大学附属医院中药房提供，丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒(南京建成生物公司)，大鼠肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)酶联免疫吸附(ELISA)测定试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)，苏木素染液、伊红染液(武汉赛维尔生物技术有限公司)，饱和油红O染色液(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1模型制备及分组 44只SPF级SD雄性大鼠，适应性喂养1周，随机取10只作为正常对照组，给予普通饲料喂养；其余大鼠为模型组，以高脂高糖饲料(普通饲料58%、精炼猪油20%、糖20%、胆固醇2%，由贵州医科大学动物房提供)喂养8周后禁食12 h，用1%链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的柠檬酸缓冲液(pH 4.5)按20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg剂量依次腹腔注射，正常对照组则注射相应剂量的柠檬酸钠缓冲液。造模72 h后，随机从正常对照组及造模大鼠中各抽取2只检测尾静脉空腹血糖(fasting blood-glucose,FBG)，并行肝组织HE染色，造模大鼠FBG≥16.7 mmol/L，且较正常对照组大鼠肝细胞内存在明显脂肪样变性，提示T2DM合并NAFLD造模成功[6]。将造模成功的大鼠根据FBG从高到低的顺序进行排序，采用随机数字表法分为模型组、糖通饮(低剂量组、中剂量组及高剂量)组，每组各8只。

1.2.2药物制备 将糖通饮饮片熬制成煎剂，低剂量糖通饮浓缩为含生药0.6 g/mL的药液，中剂量浓缩为含生药1.2 g/mL的药液，高剂量浓缩为含生药1.8 g/mL的药液，灌胃容积为20 mL/kg[7]。

1.2.3干预治疗 大鼠用药剂量按成人与大鼠等效剂量比值表计算。糖通饮低剂量组按12 g/kg、中剂量组按24 g/kg、高剂量组按36 g/kg灌胃给药，正常对照组及模型组予等容积双蒸水灌胃。各组大鼠每天灌胃1次，连续8周。灌胃期间大鼠死亡6只(模型组及糖通饮低剂量组各死亡2只，糖通饮中、高剂量组各死亡1只)。

1.2.4标本采集 大鼠灌胃治疗8周后称取体质量，禁食不禁水12 h，尾静脉采血测FBG；按300 mg/kg剂量给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后迅速开腹，腹主动脉取血静置30 min，3 000 r/min离心10 min分离血清，测定甘油三酯(triglycerides,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、MDA、SOD、TNF-α水平；取肝组织观察肝组织病理学变化及肝细胞中脂质沉积的情况。

1.2.5大鼠肝组织形态结构变化 大鼠肝组织用4%多聚甲醛溶液固定、常规脱水、石蜡包埋、切片、65 ℃烤片40 min，二甲苯脱蜡后，脱水、清洗，苏木素染液染色5 min，清洗，分化液分化4 s，HE染色5 min，清洗、脱水、透明、封片，显微镜下观察、采图。

1.2.6大鼠肝细胞脂质沉积情况 采用油红O染色法进行观察，将大鼠肝组织冰冻切片复温干燥，固定液固定15 min，清洗，晾干；油红染液浸染8 min(避光)；切片依次浸入60%异丙醇Ⅰ3 s、60%异丙醇Ⅱ分化5 s，纯水浸洗10 s；苏木素复染5 min，纯水浸洗10 s；分化液(以60%酒精为溶剂)分化8 s、水洗10 s、返蓝液返蓝1 s、浸洗10 s；封片，显微镜下观察、采图。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 FBG水平

与正常对照组相比，模型组大鼠FBG水平明显升高(P<0.01)；与模型组相比，糖通饮各剂量组FBG水平明显降低(P<0.01)；但各剂量组间差异比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠FBG水平Tab.1 FBG levels in each

2.2 大鼠血清TG、TC水平

与正常组相比，模型组大鼠血清TG、TC水平均明显升高(P<0.01)；与模型组比较，糖通饮各剂量组血清TG、TC水平均明显降低(P<0.01)；此外，糖通饮高剂量组与糖通饮低剂量组相比，血清TG水平明显下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠血清TG、TC水平Tab.2 The levels of serum TG and

2.3 大鼠血清ALT、AST水平

与正常对照组相比，模型组大鼠血清ALT、AST水平均明显升高(P<0.01)。与模型组相比，糖通饮各剂量组血清ALT水平降低(P<0.05或P<0.01)，糖通饮高剂量组血清ALT水平较低、中剂量组降低更明显(P<0.05)。与模型组比较，糖通饮高剂量组血清AST水平降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清ALT、AST水平Tab.3 The levels of serum ALT and

2.4 大鼠血清MDA、SOD、TNF-α水平

与正常组相比，模型组大鼠血清MDA、SOD、TNF-α水平均明显升高(P<0.01)。与模型组相比，糖通饮各剂量组大鼠血清MDA、SOD、TNF-α水平均降低(P<0.05或P<0.01)；但各剂量组间差异比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

2.5 大鼠肝组织观察

正常对照组大鼠肝细胞排列整齐，细胞核清晰；模型组肝细胞明显肿胀变性，排列错杂紊乱，细胞核被脂滴挤至边缘；糖通饮各剂量组较模型组均有改善，肝细胞体积缩小，脂滴数量减少，其中糖通饮高剂量组较低、中剂量组改善效果更明显。见图1。

图1 各组大鼠肝组织观察(HE，×400)Fig.1 Characteristics of liver tissues in each group (HE，×400)

2.6 大鼠肝细胞脂质沉积的情况

正常对照组大鼠肝细胞内未见明显脂质沉积，与正常对照组相比，模型组大鼠肝细胞中红色脂质沉积明显增多；与模型组相比，糖通饮各剂量组肝细胞内红色脂质沉积均有一定程度的减少，其中，高剂量组脂质减少更为明显。见图2。

图2 各组大鼠肝组织脂质沉积观察(O染色，×400)Fig.2 Observation of lipid deposition of liver tissues in each group (O staining,×400)

3 讨论

NAFLD的发病机制较复杂，包括肥胖、IR、脂代谢异常、炎性反应、氧化应激、内质网应激、肝脏自噬和肠道菌群失调等因素[8]。其中，IR是T2DM及NAFLD共同的发病机制。当IR发生时，机体抗脂解激素缺乏，增强了脂肪的分解作用，游离脂肪酸蓄积在肝内合成TG，肝细胞发生肿胀变性。随着脂代谢紊乱的发生，机体抗氧化能力下降，氧自由基大量生成，促使炎性因子TNF-α释放增加，从而介导炎性反应发生，并通过增强脂质过氧化反应致使细胞发生凋亡和损伤[9-10]。MAD是机体脂质过氧化过程的最终产物，SOD具有保护机体免受自由基攻击的作用，MDA与SOD水平的变化可反应机体脂质过氧化反应损伤的程度。当肝细胞受损时，肝细胞膜的通透性发生改变，致使肝细胞中的ALT、AST释放进入血液中，表现为血清ALT、AST水平升高。目前，西医治疗T2DM合并NAFLD主要以胰岛素增敏剂及降脂类药物为主，可一定程度地延缓该病病情进展，但容易出现肝肾损伤、横纹肌溶解等毒副作用[11]，而中医药在防治T2DM合并NAFLD的过程中收获了良好的治疗效果，且以毒副作用小、治疗成本低的优势而备受关注。研究发现，六味地黄丸、化肝煎、加味四逆散等均能明显降低T2DM及NAFLD患者血脂水平，缓解肝功能损伤[12-14]。

T2DM合并NAFLD在古籍中虽未明确记载其病名，但根据其临床表现，可归为“消渴”“肝积”“胁痛”等范畴，现代医家大多认可该病多为气阴两虚、痰浊瘀血之证[15-17]。糖通饮为全国名老中医凌湘力教授的临床经验方，该方是以生地黄、山药、山萸肉、茯苓、泽泻、丹皮、黄芪、地骨皮、丹参、草决明所组成，具有益气养阴，祛瘀泄浊之效。现代药理学研究发现，生地、茯苓、地骨皮有着抗氧化、降脂抗炎的作用[18-19]，黄芪中多糖类成分能改善IR，并可降低血脂水平[20]，牡丹皮亦具备显著降低肝损伤大鼠血清AST、ALT含量，对肝组织具有保护作用[21]。

本研究结果显示，糖通饮可明显减少T2DM合并NAFLD模型大鼠血清TG、TC含量，减轻肝细胞脂质沉积及脂肪变性程度，还可明显降低血清MDA、SOD、TNF-α、AST、ALT水平，说明糖通饮可能是通过纠正脂质代谢紊乱、增强抗氧化能力、减轻炎症反应以及脂质过氧化损伤的途径来改善T2DM合并NAFLD模型大鼠肝细胞脂肪样变及肝功能损伤的情况，从而发挥对其肝组织的保护作用。本研究还发现，糖通饮还可剂量依赖性地降低T2DM合并NAFLD模型大鼠血清ALT水平，说明糖通饮治疗T2DM合并NAFLD引起的肝功能损伤存在一定的量效关系。以上结果为临床应用糖通饮治疗T2DM合并NAFLD提供了一定的理论依据。