姜黄素纳米微粒的制备及其对人视网膜色素上皮细胞周期的影响

郑海生, 蓝育青, 钟兴武, 周怀胜, 徐家窈

(1. 中山大学中山眼科中心海南眼科医院/海南省眼科医院/海南省眼科学重点实验室 眼科,海南 海口, 570311; 2. 中山大学附属孙逸仙纪念医院 眼科, 广东 广州, 510120;3. 广东省佛山市第二人民医院 眼科, 广东 佛山, 528000)

姜黄素是从姜科和天南星科一些植物的根茎中提取的一种二酮类化合物，化学式为C21H20O6, 其具有抗新生血管、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种疗效[1-3]。但姜黄素难溶于水，体内半衰期短，目前姜黄素药物多以片剂或胶囊等剂型存在，且需要长期、反复用药，研制姜黄素的新剂型具有重要的临床意义。纳米药物相对于传统药物具有较多优势[4-7]: 药物的溶解度增大; 更容易通过血-视网膜屏障; 具有缓释性、靶向性; 减少副作用等。本研究应用纳米技术将姜黄素包载到壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒中，制作成姜黄素壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒，希望此纳米微粒具有缓慢释放姜黄素的功能，减少姜黄素的不良反应，长时间维持有效浓度，减少因反复给药对患者造成的伤害。

姜黄素在防治眼底新生血管性病变中可以发挥其抗新生血管的药理作用[8]。视网膜色素上皮细胞无论在体内或体外，缺氧均可诱导血管内皮生长因子表达，从而促进眼内血管新生[9]。因此寻找能有效抑制视网膜色素上皮细胞增殖，且毒副作用较小的防治方法尤为重要。本研究观察姜黄素壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒对体外培养的人视网膜色素上皮细胞周期的作用，探讨其对视网膜色素上皮细胞增殖的影响。

1 材料和方法

1.1 试剂与主要仪器设备

姜黄素(购自SIGMA公司)、胎牛血清(Biological Industries公司)、人视网膜色素上皮细胞(中山眼科中心医院提供，选第3～6代细胞用于实验)。光学倒置显微镜(德国 Leica MPS-30)、荧光显微镜Axioplan2 imaging(德国 Zeiss)。

1.2 实验方法

1.2.1 姜黄素纳米微粒合成: 将20 mg壳聚糖脱氧胆酸放入5 mL 磷酸盐缓冲液(PBS, pH值6.2)中，不断搅拌使壳聚糖脱氧胆酸膨胀溶解; 称量10 mg姜黄素，并用四氢呋喃将其溶解; 将溶解了姜黄素的四氢呋喃溶液缓慢滴加入壳聚糖脱氧胆酸溶液中，接着缓慢滴加蒸馏水，边搅拌边升高温度至40 ℃超过24 h, 以便残存四氢呋喃挥发; 最后将溶液离心15 min, 下层沉淀为未负载的药物，上清液即为壳聚糖脱氧胆酸负载的姜黄素纳米微粒(此方法已申请国家专利: 201010138 683.9)。

1.2.2 姜黄素纳米微粒负载效率与载药量的测定: 上述液体离心后的下层沉淀为未负载的药物，将其溶于20.0%乙醇的PBS(pH值6.2)中，采用紫外分光光度法(波长433.0 nm)测定其含量。计算姜黄素纳米微粒的负载效率与载药量的公式: 负载效率=(加入的姜黄素总量-未负载的姜黄素量)/加入的姜黄素总量×100%。载药量=(加入的姜黄素总量-未负载的姜黄素量)/投入的壳聚糖脱氧胆酸总量×100%, 未负载的姜黄素量为液体离心沉淀干燥后所得。

1.2.3 姜黄素检测波长的选择: 称1.0 mg姜黄素，溶解于100.0 mL 20%乙醇的PBS中，配成10.0 μg/mL的溶液, 20%乙醇的PBS为空白对照，用紫外-可见光分光光度计进行扫描(波长范围200.0～600.0 nm), 并将数据用Origin7.0分析，从而确定姜黄素的最大吸收波长在433.0 nm(图1), 所以姜黄素的检测波长为433.0 nm。

图1 姜黄素光谱扫描曲线(波峰为433.0 nm)

1.2.4 姜黄素的标准曲线: 准确称取2.0 mg姜黄素，用20.0%乙醇的PBS溶于100.0 mL容量瓶中，定容后分别量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL, 在10.0 mL容量瓶中用上述溶液定容。于433.0 nm波长处测量紫外光吸光度值(空白对照: 含20%乙醇的PBS), 并用Origin7.0分析，得出姜黄素在含20.0%乙醇的PBS(浓度: 1.0～10.0 μg/mL)中的吸光度标准曲线。

1.2.5 姜黄素纳米微粒的体外释放: 考察姜黄素纳米微粒在含20.0%乙醇PBS中的释放特征(动态透析法)。在透析袋中装入3.8 mL姜黄素纳米微粒溶液，将透析袋放于196.2 mL透析介质中(37.0 ℃, 100转/min), 每间隔一段时间取透析介质溶液1.0 mL, 同时补充1.0 mL介质溶液。采用紫外分光光度法测定药物的释放量，药物释放率=(药物释放量/药物总量)×100%。

1.2.6 透射电镜观察纳米微粒形态: 取少量壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒和姜黄素纳米微粒溶液分别滴至铜网支持膜上，用滤纸将多余的液体吸除，待自然干燥后用2%磷钨酸染色，晾干后在透射电镜下观察二者的形态。

1.3 细胞学实验[10]

1.3.1 CCK-8法检测壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响: 取处于对数生长期的人视网膜色素上皮细胞，用含10.0%胎牛血清的DMEM-F12培养基制备为细胞悬液(2 500.0个/mL), 在5块96孔培养板中，每孔加入100.0 μL的细胞悬液进行贴壁培养24 h，直至细胞长为单层后，分别在每块培养板中加入不同浓度的100.0 μL壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒溶液(浓度为5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL), 同时设空白对照组(只加培养液)，每组设4个复孔; 再将96孔培养板分别培养24、48 h后，向每孔中加入10.0 μL CCK-8试剂和100.0 μL含胎牛血清的DMEM-F12培养基后，于培养箱内继续培养3 h; 酶标仪检测450.0 nm处各孔光密度(OD)值。每组实验重复3次。同时光学显微镜下观察细胞形态变化。

1.3.2 流式细胞仪测定姜黄素纳米微粒和姜黄素原药对人视网膜色素上皮细胞周期时相的影响: 取对数生长期第3～6代细胞，接种于25.0 mL培养瓶中(密度5.0×105个/mL), 24 h后加含10.0%胎牛血清的DMEM-F12培养基，继续培养至48 h, 再分别加入姜黄素和姜黄素纳米微粒(浓度5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL), 对照组只加培养液, 72 h后收集贴壁细胞进行流式细胞仪分析检测，完成细胞周期分析。每组实验重复3次。

2 结 果

2.1 姜黄素纳米微粒合成及其负载效率和载药量的测定

所合成的姜黄素纳米微粒溶液为淡黄色，并可见Tyndall现象(图2)。经紫外-可见光谱法测定所合成的姜黄素纳米微粒的负载率为55.0%, 载药量为27.5%。

A: 合成的淡黄色姜黄素纳米微粒溶液; B: 纳米微粒溶液的Tyndall现象。

2.2 姜黄素在20.0%乙醇PBS中的标准曲线

用Origin 7.0进行分析，得出在浓度为1.0～10.0 μg/mL的20.0%乙醇PBS中姜黄素的吸光度标准曲线方程如下:Y= 0.007 67+0.032 62×X(X的范围是1.0～10.0 μg/mL;R=0.994 94)。

2.3 姜黄素纳米微粒的体外释放

姜黄素纳米微粒在溶液中的释放行为见图3。药物从纳米微粒中的释放在96 h后可达到平衡，药物的累积释放量为31.6%。

图3 姜黄素纳米微粒的体外释放

2.4 透射电镜观察纳米微粒形态

透射电镜下可见未负载姜黄素药物的壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒呈类球形或球形，粒径30～50 nm, 大小较为均一(图4A); 而负载姜黄素药物的壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒的粒径则明显增大为70～100 nm (图4B)。

A: 未负载姜黄素药物的壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒，粒径30.0～50.0 nm; B: 负载姜黄素的壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒，载药量27.5%, 粒径70.0～100.0 nm。

2.5 CCK-8法检测壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

不同浓度的壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒作用于人视网膜色素上皮细胞24、48 h后的OD值与对照组(只加培养液)相比，差异无统计学意义(F=0.381、0.281,P>0.05)。见表1。光镜下s观察细胞形态未发生变化，提示单纯壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒对人视网膜色素上皮细胞无毒性，安全性良好。见图5。

A: 24 h; B: 48 h; C: 壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒作用于人视网膜色素上皮细胞前细胞形态。图5 壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒作用于人视网膜色素上皮细胞后细胞形态(放大倍数100倍)

表1 不同浓度壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒作用于人视网膜色素上皮细胞24、48 h OD值

2.6 流式细胞仪测定姜黄素及姜黄素纳米微粒对人视网膜色素上皮细胞的细胞周期影响

在5.0～40.0 μg/mL浓度范围内，姜黄素及姜黄素纳米微粒作用于人视网膜色素上皮细胞均出现S期细胞百分比下降，而G0～G1期细胞百分比上升，说明人视网膜色素上皮细胞进入细胞增殖期减少。见图6。

A: 对照; B: 姜黄素纳米微粒5.0 μg/mL; C: 姜黄素纳米微粒10.0 μg/mL; D: 姜黄素纳米微粒20.0 μg/mL; E: 姜黄素纳米微粒40.0 μg/mL; F: 姜黄素 5.0 μg/mL; G: 姜黄素 10.0 μg/mL; H: 姜黄素 20.0 μg/mL; I: 姜黄素40.0 μg/mL。图6 流式细胞仪检测姜黄素纳米微粒及姜黄素对人视网膜色素上皮细胞周期的影响结果

3 讨 论

高分子化合物是制备纳米控释系统的主要载体材料，常以天然的大分子体系和合成的可生物降解的聚合物体系为主。本研究中所用的壳聚糖是一种天然高分子聚合物，其具有良好的黏附性、生物相容性及可降解性[11-12]。本研究所合成的姜黄素壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒选用了壳聚糖脱氧胆酸作为姜黄素的载体，该聚合物在水溶液中可形成纳米微粒[13]。本研究通过CCK-8法比较对照组和不同浓度壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒组的细胞增殖抑制率，结果得出各浓度壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒组与对照组差异无统计学意义(P>0.05), 同时在倒置显微镜下观察人视网膜色素上皮细胞的形态未发生变化，说明壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒对人视网膜色素上皮细胞的生长无影响，提示壳聚糖脱氧胆酸对人视网膜色素上皮细胞无毒性，可作为本研究的药物纳米载体。研究[14]发现，包载姜黄素的壳聚糖/聚己内酯纳米微粒在人宫颈癌细胞Hela细胞和人脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1细胞中的细胞毒性与游离姜黄素无显著差异。纳米药物的缓释机制有[15]: ① 吸附或连接于粒子表面的药物与纳米粒脱离; ② 纳米胶束内的药物不断向外扩散; ③ 纳米胶束本身不断被降解，药物不断从胶束内部被释放出来。本研究发现，姜黄素纳米微粒的载药量为27.5%, 与LI J J等[16]采用脱绒法制备的姜黄素白蛋白纳米颗粒载药量24.0%较为接近。药物从纳米微粒中的释放在96 h后可达到平衡，药物的累积释放量为31.6%。体外扩散释放实验证明，本研究所合成的姜黄素壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒具有缓慢释放功能。

目前，姜黄素已被作为一种抗癌新药[17]。同时已有学者[18-19]对姜黄素的药物代谢动力学及癌症治疗的生物有效剂量进行了相关研究。姜黄素在眼科的应用研究主要集中于其抗新生血管的作用，可能对糖尿病视网膜病变和角膜碱烧伤等疾病发挥重要的治疗作用[8, 20]。龚凌等[21]、SHUKLA S等[22]发现姜黄素可显著抑制人胚胎视网膜色素上皮细胞增殖。凋亡是抑制细胞增殖的重要原因[22-24], 本研究结果显示，在5.0～40.0 μg/mL浓度范围内，姜黄素及姜黄素纳米微粒作用于人视网膜色素上皮细胞均出现G0～G1期细胞百分比上升, S期细胞百分比下降，提示人视网膜色素上皮细胞进入细胞增殖期减少，姜黄素可以阻滞人视网膜色素上皮细胞周期于S期，可能是姜黄素抑制细胞增殖的重要原因之一[25], 而姜黄素纳米微粒可以提高其阻滞能力。李松霖等[26]将相同浓度的姜黄素纳米微粒和姜黄素作用于Lewis肺癌细胞24 h后，姜黄素纳米微粒组、姜黄素组和阴性对照组Lewis肺癌细胞的凋亡率分别为67.69%、7.43%和4.94%, 同时发现姜黄素可以阻滞Lewis肺癌细胞周期于S期，与本研究结果一致。但本研究仅研究了壳聚糖脱氧胆酸纳米微粒与细胞在不同时间内的相互作用的关系，及姜黄素纳米微粒对人视网膜色素上皮细胞周期的影响; 壳聚糖脱氧胆酸及姜黄素纳米微粒与人视网膜色素上皮细胞的相互作用关系，及对人视网膜色素上皮细胞的增殖的影响还需开展更深入的研究进行明确。

综上所述，壳聚糖脱氧胆酸包载的姜黄素纳米微粒能持续释放出姜黄素，具有较好的缓释功能，载药材料壳聚糖脱氧胆酸对人视网膜色素上皮细胞的安全性及生物相容性较好。本研究为进一步探讨姜黄素纳米微粒对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响提供了依据。