无菌部位侵袭性念珠菌感染的临床特征、药物敏感性及风险因素分析

夏金星, 鲁凡博, 黄 玮, 徐元宏

(安徽医科大学第一附属医院, 1. 检验科, 2. 肿瘤内科, 安徽 合肥, 230022)

侵袭性念珠菌感染是由念珠菌(又称假丝酵母菌)所致的侵袭性感染，其表现为皮肤黏膜病变、真菌血症以及多个部位的局灶性感染，且临床症状因感染部位不同而异[1]。全球每年逾25万人遭受侵袭性念珠菌感染，死亡率高达70%, 其已成为公共卫生领域的重大威胁[2]。住院患者尤其重症患者因病情危重、住院时间较长以及接受各种侵入性或有创性诊疗干预等，致使免疫系统功能受损，是念珠菌感染的高危人群[3-5]。研究[2]表明，真菌感染作为全球常见感染之一，其患者数量正逐年上升。侵袭性真菌的菌种差异使得感染的严重程度、治疗药物选择和疾病预后等均有所不同[6]。因此，获得本地区侵袭性真菌感染的流行病学特征及药物敏感谱是临床早期治疗和改善患者预后的关键。

抗真菌感染药物中，三唑类药物尤其是氟康唑具有广谱抗真菌作用、药物靶向性强、水溶性好、生物利用度高及毒副作用低等优点，常作为临床一线治疗药物[7]。唑类药物直接作用于念珠菌细胞膜麦角固醇合成中的关键酶，使合成通路受阻、细胞膜完整性受损及菌体内毒性甲基化固醇类物质累积而发挥抗真菌效应[8]。然而，随着临床上长期、广泛地使用广谱抗生素和频繁预防性经验用药，住院患者侵袭性真菌感染率逐年攀升，病原菌构成谱和耐药谱不断变迁，给临床真菌感染诊治带来困难[5, 9]。合理、有效运用抗真菌药物对住院患者尤其是重症感染者预后尤为重要。为了解住院患者侵袭性真菌感染的病原菌种类及耐药性特点，以提供及时、准确的临床诊疗依据，本研究分析了内、外科住院患者念珠菌感染无菌部位的临床分布特征、相关风险因素以及5种抗真菌药物对念珠菌的体外抑菌活性情况，并进一步探究了唑类耐药菌可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

全程跟踪研究安徽医科大学第一附属医院2018年1月—2019年6月临床住院患者116例，直至患者病程转归。根据欧洲癌症研究和治疗组织/真菌病研究组修订的侵袭性真菌病(IFD)指南和中华医学会中国专家共识，将上述患者分为2组，其中41例患者住院期间全程未出现真菌感染纳入阴性对照组，余者皆纳入感染组(n=75)。收集感染组患者住院期间血液、无菌体液以及分泌物等无菌部位感染真菌共计80株，包括白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌以及克柔念珠菌等。该实验包括了同一患者不同部位来源的不同菌株(或相同菌株但具不同药敏特性)，并剔除了同一患者同一部位反复出现的相同菌株。以上菌株均经科玛嘉念珠菌显色培养基/沙保弱琼脂培养基培养和基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)全自动生物鉴定系统(法国梅里埃公司VITEK MS质谱仪)鉴定。质控标准菌株包括近平滑念珠菌ATCC 22019、克柔念珠菌ATCC 6258和热带念珠菌ATCC 750。

1.2 试剂与设备

ATB FUNGUS 3酵母菌药敏试剂盒(微量稀释法)、ATB Expression仪均购自法国生物梅里埃公司。柱式酵母总RNA抽提纯化试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司。Thermo NanoDrop分光光度计仪购自美国Thermo Scientific公司。ABI 7300 PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。Tanon EPS-300水平式电泳仪购自上海天能科技有限公司。Bio-Rad Gel Doc XR凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。UNIQ柱式细菌基因抽提试剂盒、4S Red Plus核酸染料以及Taq PCR Master Mix购于上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 引物

根据GenBank数据库提供的相关基因序列，委托上海生工生物工程股份有限公司合成ERG3和ERG11基因引物。ERG3基因上、下游引物序列分别为: 5′-ATGGATATCGTACTAGAAATTTGT G-3′, 5′-TCATTGTTCAACATATTCTCTATC C-3′;ERG11基因上、下游引物序列分别为: 5′-GTTTTCTACTGGATCCCATG-3′, 5′-TACATCTGTGTCTACCACC-3′[10]。

1.4 方法

1.4.1 菌株鉴定和体外药敏试验: 选用科玛嘉念珠菌显色培养基/沙保弱琼脂培养基和法国梅里埃公司VITEK MS质谱仪，遵循相关操作规程进行病原菌的培养与鉴定。采用法国梅里埃公司ATB FUNGUS 3真菌药敏试剂盒进行药敏试验，抗真菌药物包括两性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑，按照说明书进行操作。质控菌株按照说明书选择近平滑念珠菌ATCC 22019、克柔念珠菌ATCC 6258和热带念珠菌ATCC 750。

1.4.2 念珠菌基因组DNA及目的基因提取和扩增: 严格遵照UNIQ柱式细菌基因抽提试剂盒说明书，提取热带念珠菌临床分离株基因组DNA。聚合酶链反应(PCR)反应总体系为50 μL: 上游引物(10 μmol/L) 2 μL, 下游引物(10 μmol/L) 2 μL, Taq PCR Master Mix 25 μL, 蒸馏水 19 μL, DNA模板 2 μL。PCR产物经1%凝胶电泳、4S Red Plus 核酸染料染色后，置凝胶成像仪中照相分析。PCR反应条件如下: 预变性阶段, 94 ℃ 5 min; 扩增阶段，变性94 ℃ 30 s、退火50 ℃ 90 s、延伸72 ℃ 90 s, 循环扩增35次; 终延伸阶段, 72 ℃ 8 min; 4 ℃保存。PCR产物纯化后，委托通用生物有限公司进行测序，均做双向测序。利用DNA序列分析软件(DNASTAR, Inc. ,Madison, WI, USA), 将扩增产物基因序列与GenBank数据库提供基因序列(GenBank accession no. : XM_002550 939.1)进行对比分析，确定基因突变位点。

1.5 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计数资料以[n(%)]表示，数据组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验;P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 菌种鉴定及其标本类型分布

该研究全程跟踪分析了116例住院患者，其中75例患者发生侵袭性念珠菌感染，余者无真菌定植及念珠菌感染。所得样本通过血培养/真菌显色培养基/沙保弱培养基培养，分离后经MALDI-TOF MS全自动生物质谱鉴定系统分析鉴定，共获80株念珠菌(图1)。白色念珠菌是无菌部位侵袭性真菌感染最为常见的致病菌，感染率达45.00%(36/80)。而光滑念珠菌和热带念珠菌是其最常见的非白色念珠菌，两者感染率分别是32.50%(26/80)、13.75%(11/80)。其他念珠菌感染率均小于10.00%(图1C)。尿液为最常见的标本类型，构成比达50.00%(40/80); 其次是分泌物和血液，构成比分别为27.50%(22/80)、5.00%(4/80)。见表1。

A: 念珠菌培养物革兰染色示例, Ⅰ～Ⅳ分别是白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌,比例尺为10 μm; B: 念珠菌质谱鉴定示例, i～iv分别为白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌; C: 侵袭性念珠菌菌株分布(n=80)。图1 侵袭性念珠菌菌种鉴定及菌株分布

表1 临床菌株标本类型分布特征[n(%)]

2.2 抗真菌药物对侵袭性念珠菌体外抑菌效果

大多数念珠菌在体外对两性霉素B和5-氟胞嘧啶高度敏感，平均敏感率超过98.00%, 其中光滑念珠菌对两性霉素B的敏感性为96.20%。然而，侵袭性念珠菌对唑类药物表现出不同的体外敏感程度。对于白色念珠菌，三唑类药物氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的敏感性分别为94.40%、94.40%和100.00%。对于光滑念珠菌，三唑类药物氟康唑和伏立康唑的体外抑菌活性均超95.00%,而伊曲康唑对其体外抑菌活性仅为76.90%。对于近平滑念珠菌，氟康唑与伏立康唑的体外抑菌活性均是83.30%, 优于伊曲康唑(66.70%)。对于克柔念珠菌，伏立康唑的体外抑菌活性则达100.00%。对于热带念珠菌，两性霉素B和5-氟胞嘧啶的体外抑菌活性都为100.00%; 然而，三唑类药物对热带念珠菌敏感性普遍偏低，其中伊曲康唑体外抑菌活性最低，仅为54.50%, 其最低抑菌浓度(MIC)范围为0.12～4.00 μg/mL, MIC50和MIC90分别为0.13 μg/mL、2.00 μg/mL; 氟康唑和伏立康唑对热带念珠菌体外抑菌活性分别为63.60%和81.80%。见表2。

表2 抗菌药物对念珠菌的体外抑菌效果(n=80)

对所有唑类耐药热带念珠菌临床分离株(共4株)的ERG3和ERG11基因进行PCR和测序分析。经凝胶电泳分析后，其条带大小与DNA marker比较，位置相符且无其他非特异性扩增。将耐药株的唑类耐药相关基因ERG3与ERG11测序序列分别进行BLAST比对，以起始密码子ATG中A作为序列起始计数1, 确定突变位点。

ERG11基因测序结果显示, 4株热带念珠菌耐药株ERG11基因同时存在4处点突变(T225C、G264A、A395T和C461T), 其中2处为同义突变(T225C和G264A), 另2处为错义突变(对应氨基酸残基分别更替为Y132F和S154F)(图2)。ERG3基因测序结果显示, 4株热带念珠菌耐药株中仅2株ERG3基因均存在1处点突变(G366A), 且为同义突变。

通过仿PBD-blast(http: //www.pdb.org)PDB ID 5JLC结构图,计算预测4株唑类耐药热带念珠菌ERG11蛋白分子唑类药物进出通道结构内部和开口位置[11]; 红色: 突变位点Y132; 黄色: 突变位点S154; 标准参考序列源自热带念珠菌GenBank(Accession no.:XM_002550 939.1)序列信息。图2 热带念珠菌ERG11酶分子三维结构模型图与突变位点

2.3 侵袭性念珠菌感染的临床分布特征

本研究中，侵袭性念珠菌感染患者性别构成比基本相同，即男性患者占43.75%、女性患者占56.25%。但不同性别间常见侵袭性念珠菌种类有所不同，男性住院患者最常见侵袭性念珠菌为白色念珠菌(占所获相应菌株数比率为54.29%, 19/35), 其次为光滑念珠菌(20.00%, 7/35)与热带念珠菌(14.29%, 5/35); 女性住院患者主要侵袭性念珠菌则为光滑念珠菌(42.22%, 19/45), 而白色念珠菌(37.78%, 17/45)和热带念珠菌(13.33%, 6/45)次之。其中1株克柔念珠菌来自女性患者。侵袭性念珠菌感染患者年龄与感染率呈现正相关趋势。感染患者平均年龄为(58.89±19.23)岁，中位数年龄为63岁。易受侵袭性念珠菌感染的年龄段人群主要为50岁以上住院患者，构成比达70.00%; 此年龄段中，白色念珠菌为主要致病菌，占48.21%(27/56), 其次包括光滑念珠菌(26.79%, 15/56)、热带念珠菌(14.29%, 8/56)与近平滑念珠菌(10.71%, 6/56); 尤其在年龄大于65岁患者中，与对照组(10株)相比，感染组患者(34株)更易感染侵袭性念珠菌，差异有统计学意义(P<0.05), 且白色念珠菌和光滑念珠菌感染比率分别为47.06%(16/34)、32.35%(11/34)。而在0～14岁年龄段，侵袭性念珠菌感染构成比仅为3.75%, 皆为白色念珠菌感染。15～49岁年龄段分离出克柔念珠菌1株。

侵袭性念珠菌感染患者住院时间与感染率亦呈正相关趋势。半数以上侵袭性念珠菌感染出现于住院14 d以上的患者群(63.75%, 51/80), 与对照组(31.71%, 13/41)比较该住院时间可归为显著性易感风险因素(P<0.001); 而住院时间<7 d的患者仅占7.50%(6/80)。住院时间>14 d和<7 d患者中，白色念珠菌为最常见侵袭性真菌，分别占47.06%(24/51)和66.67%(4/6)。而住院时间7～14 d的患者群中，光滑念珠菌是最为常见的侵袭性真菌，占43.48%(10/23), 且分离出1株克柔念珠菌。侵袭性念珠菌感染科室分布情况同对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.001)。内科住院患者感染念珠菌风险较低且以光滑念珠菌(48.28%, 14/29)为主; 外科患者住院期间感染念珠菌的风险相对较高，尤以白色念珠菌(54.90%, 28/51)感染为甚; 对照组来自内、外科系统菌株数分别为30株与11株。在疾病临床转归方面与对照组(未跟踪到任何病情恶化事件)比较，感染组患者病情恶化率较高(16.25%, 13/80)(P=0.005), 且出现死亡病例，而对照组没有患者死亡。

本研究进一步分析了与侵袭性念珠菌感染相关特征性临床风险因素。由侵入性操作引起的风险因子包括: 尿道插管，感染组36株(45.00%)与对照组7株(17.07%)(P=0.002); 气管插管，感染组23株(28.75%)与对照组4株(9.76%)(P=0.018); 呼吸机辅助，感染组24株(30.00%)与对照组4株(9.76%)(P=0.012); 气管切开术，感染组12株(15.00%)与对照组0株(P=0.022); 住院期间手术史，感染组41株(51.25%)与对照组4株(9.76%)(P<0.001)。其中，呼吸机辅助和气管切开术的患者主要受白色念珠菌与光滑念珠菌的侵袭性感染，且感染概率相同; 而其他风险因素主要引起白色念珠菌感染，其次为光滑念珠菌感染。此外，癌症患者(22.50%, 18/80)感染念珠菌的风险高于对照组(2.44%, 1/41), 差异具有统计学意义(P=0.004)。感染组与对照组间诸如动/静脉插管、内镜、血液/腹膜透析、免疫抑制剂治疗、糖尿病、肝硬化、烧伤、肺部感染、颅内出血以及合并细菌感染等危险因素比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

住院患者是侵袭性真菌感染的重要人群，尤其是创伤、手术及烧伤等患者，提示皮肤、黏膜等屏障受损使念珠菌感染风险增加。此外，某些重症住院患者因病情处置所需，静脉或泌尿道导管留置、气管插管或切开、呼吸机以及广谱抗生素等的广泛使用，常会破坏皮肤、生殖道等黏膜屏障、呼吸道解剖屏障和机体菌群屏障，进一步增加了包括念珠菌在内的侵袭性真菌感染风险[3]。同时，侵袭性念珠菌感染与不合理使用抗真菌药物的经验治疗息息相关[1, 12]。因此，早期合理、规范使用抗真菌药物治疗，有望改善侵袭性念珠菌感染患者的预后[13]。

越来越多的唑类抗真菌药物应用于侵袭性真菌病的临床预防性或经验性治疗，导致侵袭性念珠菌流行病学趋势不断改变，非白色念珠菌感染率逐年递增，新的真菌病原体亦层出不穷，最终导致念珠菌对唑类药物的敏感性逐渐减弱[12, 14]。本研究显示，住院患者中，白色念珠菌仍然是导致侵袭性念珠菌感染的主要致病菌，光滑念珠菌和热带念珠菌则是侵袭性念珠菌感染的主要非白色念珠菌。有学者[15]报道，近平滑念珠菌是导致住院患者侵袭性念珠菌感染的主要非白色念珠菌，该结论的出入或与医院间标本来源、标本种类、患者年龄、住院时长及基础疾病的不同相关。本研究的标本来源主要是住院患者的尿液、分泌物和血液，患者平均住院时间较长，并存在呼吸道及泌尿道插管等干预，导致侵袭性念珠菌感染的发生率增高。

在侵袭性念珠菌感染组中，患者多数为年长者(中位数年龄达63岁)，超过一半患者的年龄超过50岁，且住院时间相对较长，住院时间超过14 d。前者或随年龄增长，存在的基础疾病风险增加; 后者或因住院时间延长，加之患者病情可能本就更为严重，使用抗生素及有创性操作的时间和频次增多，因而更易遭受侵袭性念珠菌的感染[16-17]。本研究中，尿道插管、气管插管、使用呼吸机、气管切开术及住院期间手术史、癌症是住院患者发生侵袭性念珠菌病的高危指征。侵入性操作如气管切开术，通常是导致重症住院患者念珠菌定植/感染概率增加的关键因素。既往研究[18]表明，多种因素如癌症患者由于放疗或化疗引起的不良反应，或由于癌细胞播散累及多脏器致宿主免疫功能下降、大量使用激素、不合理运用广谱抗生素以及其他外因等影响，易导致院感相关念珠菌感染的发生。

念珠菌耐药机制涉及诸多因素，主要与外排泵基因过度表达、基因突变、细胞壁构成改变及生物膜形成等相关[19]。随着真菌耐药率的不断升高，需要了解念珠菌的耐药情况，尤其是目前临床常用的三唑类药物的耐药，探讨其耐药机制可为防治侵袭性念珠菌感染提供理论依据。本研究真菌药敏结果显示，三唑类药物、两性霉素B和5-氟胞嘧啶对大部分侵袭性念珠菌感染均具有较好的药物敏感性。然而，氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑等三唑类抗真菌药物出现了主要针对热带念珠菌耐药现象。热带念珠菌是一种临床常见的条件致病真菌，其耐药机制较为复杂，除与菌株生物膜形成、细胞代谢反应及基因突变等有关外，还与2种关键基因(ERG3和ERG11)密切相关[20]。ERG3基因编码念珠菌细胞膜麦角甾醇合成途径后期阶段的一种关键酶。ERG11基因编码羊毛甾醇14a-去甲基化酶，为念珠菌细胞膜麦角甾醇合成途径关键酶，是临床唑类药物作用的靶酶。常用的唑类药物如氟康唑通过与其结合使靶酶失活而达到抗菌作用[19]。研究[19, 21]发现,ERG3和ERG11突变可引起其编码的酶活性和三维结构发生改变，降低其对唑类药物的亲和力，使药物难以发挥有效作用。本研究共收集11株热带念珠菌，其中4株对至少1种唑类药物耐药，耐药率达36.36%。菌株ERG11测序结果显示, 4株耐药菌株同时出现A395T和C461T基因点突变(错义突变)，三维蛋白分子建模分析表明，其(Y132F和S154F)分别位于唑类药物进出通道的通道结构内部和通道开口处，推测可能是2处突变发挥协同效应，使药物作用靶酶(ERG11蛋白)产生明显改变，进而降低药物与靶酶的亲和力[11, 21]。ERG3测序显示，仅2株耐药菌株发生1处同义突变，该突变在其他研究中也有报道，但具体作用有待进一步探究。本研究受相应真菌病诊断标准、真菌感染率及区域因素等限制，全程跟踪收集研究样本比例相对有限或为本研究不足之处; 但对相关疾病区域性临床诊疗具有一定指导或参考意义。

综上所述，本研究对近年安徽医科大学第一附属医院住院患者无菌部位侵袭性念珠菌感染的菌株分布、临床特征和真菌药物敏感性情况进行了系统性跟踪分析。研究结果显示，白色念珠菌为住院患者侵袭性念珠菌感染的主要致病菌，患者年龄、住院时间、住院期间有创性干预(尿道插管、气管插管、呼吸机辅助、气管切开术和手术史)以及癌症等可考虑作为真菌感染的主要危险因素。两性霉素B、5-氟胞嘧啶及唑类药物对非热带念珠菌均具有良好的体外抑菌活性，而热带念珠菌ERG11基因2处错义突变(A395T和C461T)可能与唑类药物耐药密切相关。但热带念珠菌对唑类药物耐药存在多种耐药机制且过程复杂，需不断深入与持续性研究。本研究为住院侵袭性念珠菌感染患者合理、规范使用抗真菌药物提供参考，以期降低临床侵袭性念珠菌感染死亡率，提高诊疗效果。