靶向miR-188-3p/HMGB2抑制circ_0008035对肺癌细胞生物行为的影响

李宁 陈瑾 张录民

肺癌是最常见和最致命的恶性肿瘤之一，目前肺癌的诊断策略仍然难以在早期识别出该疾病[1]。因此，需要进一步的研究来探索新颖的诊断和治疗生物标志物，并揭示肺癌进展的详细潜在机制。环状RNA(circular RNA，circRNA)是一种新型的非编码RNA，由没有自由末端的共价闭环结构形成[2]。由于高通量测序的进展，已发现多种circRNA在肺癌等癌症中呈现异常表达，这些circRNA可能对肺癌的早期诊断和治疗产生广泛影响[3,4]。circRNA主要依靠微小RNA(micro RNA，miRNA)海绵发挥其生物学功能[5]。在肺癌中，人们已经认识到一些circRNA，例如CircRNA CDR1as[6]和circRNA_102179[7]起着竞争性内源性RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)的作用，以减轻对miRNA靶标的抑制作用。circ_0008035是一种新鉴定的在胃癌中上调的circRNA，通过靶向miR-375/YBX1轴促进胃癌的发生[8]，但circ_0008035在肺癌中的功能和机制仍然未知。本研究通过生物学预测发现，circ_0008035与miR-188-3p存在互补位点，miR-188-3p与高迁移率族蛋白B2(high-mobility group protein B2，HMGB2)具有靶向结合位点。miR-188-3p过表达可以抑制非小细胞肺癌进展[9]，敲减HMGB2可抑制肺腺癌细胞的增殖[10]。然而，miR-188-3p和HMGB2是否涉及肺癌中circ_0008035的功能尚不确定。因此，本研究探讨circ_0008035在肺癌中的表达和对肺癌细胞增殖、凋亡的影响，结合miR-188-3p/HMGB2探讨circ_0008035的分子机制。

1 材料与方法

1 标本 2017年月3至2019年11月首都医科大学附属复兴医院和吉林省人民医院招募25例未接受化学疗法或放射疗法的肺癌患者，患者均知情且同意参加研究，本研究得到医院伦理委员会的批准。手术过程中收集患者的肺癌组织和癌旁组织，并保存在-80℃下直至分离RNA。

1.2 细胞与试剂 肺癌A549细胞(美国ATCC)，circ_0008035干扰物(si-circ_0008035)、干扰物阴性对照si-NC、miR-188-3p mimics、miR-188-3p inhibitors(anti-miR-188-3p)、mimics阴性对照(miR-NC)(上海Gene Pharma)，PrimeScrip RT试剂盒(大连Takara)，AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京Vazyme)，RIPA缓冲液、ECL试剂(北京Solarbio)，HMGB2兔多克隆抗体(美国Abcam)，膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙锭(Propidium Iodide，PI)细胞凋亡检测试剂盒(杭州联科)，Dual-Glo荧光素酶测定系统(美国Promega)。

1.3 细胞培养与转染 A549细胞培养于37℃、含5% CO2的环境中，与含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基一起生长。A549细胞以5×105个/孔接种在6孔板中，培养至80%融合，根据Lipofectamine 2000试剂的操作说明，在A549细胞中转染si-NC(si-NC组)、si-circ_0008035(si-circ_0008035组)、miR-NC(miR-NC组)、miR-188-3p mimics(miR-188-3p组)，或共转染si-circ_0008035和anti-miR-188-3p(si-circ_0008035+anti-miR-188-3p组)。另设正常培养的细胞为对照(con组)。转染48 h后，将转染成功的A549细胞用于后续检测。

1.4 实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)circ_0008035和表达 肺癌组织和A549细胞在TRIzol试剂中裂解，以提取总RNA。在NanoDrop 2000c分光光度计上测量RNA浓度后，用PrimeScrip RT试剂盒合成cDNA。然后使用AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix在ABI 7500 PCR系统上确定circRNA与miRNA相对表达，并使用2-ΔΔCt方法进行计算。GAPDH或U6被用作内参。引物序列如下：circ_0008035：5’-CTACCAGCCAAACACCGCT-3’和R：5’-TCCAGGAATCTGAAGGACCCA-3’；miR-188-3p：F：5’-CUCCCACATGCAGGG-3’和R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；GAPDH：F：5’-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3’和R：5’-ACGTCGCACTTCATGATCGAG-3’；U6：F：5’-CTCGCTTCGGCACA-3’和R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.5 Western blot 在RIPA缓冲液中分离A549细胞蛋白，定量后将40 μg样品在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并转移到硝酸纤维素膜上。将膜在5%的牛血清白蛋白中封闭1 h，然后与HMGB2(1∶2 000稀释)、GAPDH(1∶3 000稀释)一抗孵育过夜，与辣根过氧化物酶标记的IgG二抗(1∶5 000稀释)孵育2 h。印迹暴露于增强的化学发光后，以GAPDH为归一化参比，通过Image J分析印迹。

1.6 细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8)细胞增殖测定 将A549细胞重悬并以1×104个/孔接种在96孔板中。细胞铺板后，在48 h向每个孔中加入10 μl CCK-8溶液，然后在5% CO2和37℃下孵育2 h。使用BioTek酶标仪测量450 nm处的吸光度OD值。使用以下公式计算抑制率：100%-(空白组OD值/试验组OD值)×100%。

1.7 平板克隆形成试验 将A549细胞(每孔200个细胞)接种到6孔板，在5% CO2和37℃下与完全培养基一起孵育2周，直到出现明显的细胞克隆。用PBS小心洗涤细胞，4%多聚甲醛固定15 min，用吉姆萨溶液染色15 min，用自来水洗涤并风干，显微镜下计数克隆形成数。

1.8 流式细胞术 根据说明书，将2×105个A549细胞在黑暗中用Annexin V-FITC和PI染色15 min。流式细胞仪用于检测细胞凋亡率。

1.9 双荧光素酶活性检测 在Circular RNA Interactome软件中预测circ_0008035和miR-188-3p的靶向结合，targetscan软件中预测miR-188-3p和HMGB2的靶向结合。通过在pmir-GLO载体中插入含有miR-188-3p互补位点的野生型(WT)circ_0008035或HMGB2序列来构建WT-circ_0008035或WT-HMGB2荧光素酶报告载体。通过突变miR-188-3p的互补位点，构建突变型(MUT)-circ_0008035或MUT-HMGB2荧光素酶报告载体。将这些载体与miR-188-3p mimics或miR-NC一起转染到A549细胞中。转染48 h后，使用Dual-Glo荧光素酶测定系统测量荧光素酶活性。

2 结果

2.1 circ_0008035和miR-188-3p在肺癌组织中的表达 肺癌组织中circ_0008035表达较癌旁组织增加，miR-188-3p表达较癌旁组织减少(P<0.05)。见表1。

表1 circ_0008035和miR-188-3p在肺癌组织中的表达

2.2 沉默circ_0008035对A549增殖凋亡的影响 在A549细胞中沉默circ_0008035后，与con组或si-NC组相比，si-circ_0008035组circ_0008035表达减少，miR-188-3p表达增加，HMGB2蛋白表达减少，细胞抑制率与凋亡率增加，克隆形成数减少(P<0.05)；而这些指标在con组和si-NC组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1，表2。

图1 沉默circ_0008035对A549凋亡及HMGB2蛋白表达的影响

表2 沉默circ_0008035抑制A549增殖诱导凋亡

2.3 miR-188-3p对A549增殖凋亡的影响 在A549细胞中过表达miR-188-3p后，与con组或miR-NC组相比，miR-188-3p组miR-188-3p表达增加，HMGB2蛋白表达减少，细胞抑制率与凋亡率增加，克隆形成数减少(P<0.05)；而这些指标在con组和miR-NC组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2，表3。

表3 miR-188-3p抑制A549增殖诱导凋亡

图2 miR-188-3p对A549凋亡及HMGB2蛋白表达的影响

2.4 circ_0008035、miR-188-3p和HMGB2靶向关系的验证 预测软件Circular RNA Interactome和targetscan对circ_0008035与miR-188-3p、miR-188-3p与HMGB2靶向结合的示意图。miR-188-3p组WT-circ_0008035、WT-HMGB2荧光素酶活性均低于miR-NC组(P<0.05)，2组MUT-circ_0008035、MUT-HMGB2荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。见表4，图3。

表4 双荧光素酶报告实验

图3 circ_0008035和miR-188-3p的互补序列及miR-188-3p和HMGB2的互补序列

2.5 抑制miR-188-3p对沉默circ_0008035处理的A549增殖凋亡的影响 si-circ_0008035组miR-188-3p表达比con组高，HMGB2蛋白表达比con组低，细胞抑制率与凋亡率比con组多，克隆形成数比con组少(P<0.05)；si-circ_0008035+anti-miR-188-3p组miR-188-3p表达比si-circ_0008035组低，HMGB2蛋白表达比si-circ_0008035组高，细胞抑制率与凋亡率比si-circ_0008035组少，克隆形成数比si-circ_0008035组多(P<0.05)。见图4，表5。

图4 抑制miR-188-3p可逆转沉默circ_0008035对A549凋亡及HMGB2蛋白表达的检测

表5 抑制miR-188-3p可逆转沉默circ_0008035对A549增殖的抑制凋亡的诱导作用

3 讨论

最近几十年中，越来越多的报道指出circRNA对癌症进展的重要影响[11]。某些circRNA表达失调，并与肺癌中的细胞行为和肿瘤发生有关。例如，hsa_circ_0012673通过miR-320a/LIMK18521轴促进肺癌细胞增殖和侵袭[12]。CircRNA BIRC6通过海绵miR-145促进非小细胞肺癌细胞进展[13]。hsa_circ_0008035在骨肉瘤患者血清、组织和细胞中高表达，沉默hsa_circRNA_0008035通过负调节miR-375的表达阻止骨肉瘤细胞的生长和迁移[14]。circ_0008035在胃癌组织和细胞中上调，circ_0008035沉默抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡[15]。此外，circ_0008035充当miR-599的海绵上调EIF4A1促进胃癌进展。而关于circ_0008035对肺癌的影响尚未可知。本研究显示，circ_0008035在肺癌组织中表达升高，沉默circ_0008035使A549细胞增殖抑制率和凋亡率增加，克隆形成数减少，说明沉默circ_0008035可抑制肺癌细胞增殖，并诱导其凋亡，与前人[15]研究吻合。

ceRNA机制表明circRNA与miRNA竞争性结合以减轻对miRNA靶基因的抑制，从而在转录水平上调节基因的表达[16]。circRNA作为ceRNA参与生物学过程，例如肿瘤细胞的增殖，凋亡，侵袭和迁移[17]。Yao等[9]指出，circGFRA1通过使miR-188-3p海绵化来促进非小细胞肺癌细胞的增殖。Gao等[18]揭示circ_0109291通过使miR-188-3p海绵化以增加ABCB1表达来促进口腔鳞状细胞癌的顺铂耐药性。本研究的生物信息学预测到circ_0008035可能与miR-188-3p靶向结合，这暗示circ_0008035可能充当ceRNA。当沉默circ_0008035时，miR-188-3p的表达上调。我们还通过双荧光素酶报告基因分析验证了circ_0008035与miR-188-3p的相互作用。同时，miR-188-3p在胰腺癌[19]、肝细胞癌等[20]多种肿瘤中被发现下调，可以减缓乳腺癌MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭[21]。本研究显示，miR-188-3p在肺癌中表达下调，起肿瘤抑制剂的作用，因为过表达miR-188-3p促进肺癌细胞凋亡和抑制增殖。此外，抑制miR-188-3p可逆转沉默circ_0008035对A549细胞增殖的抑制及其对细胞凋亡的诱导作用，结果证明circ_0008035充当miR-188-3p的海绵。

HMGB2被认为是非小细胞肺癌的癌基因，在非小细胞肺癌肿瘤组织中的表达增加[22]。HMGB2在宫颈癌中高表达，可能通过激活AKT信号通路促进宫颈癌细胞增殖[23]。miR-329可以通过靶向下调HMGB2来抑制黑色素瘤的进展[24]。HMGB2可以作为miR-874的靶点参与胃癌细胞的生长和转移[25]。本研究发现HMGB2是miR-188-3p的靶基因。且HMGB2表达被过表达miR-188-3p所抑制，被沉默circ_0008035所抑制。且沉默circ_0008035对A549细胞HMGB2表达的抑制作用被抑制miR-188-3p逆转。这些发现表明，circ_0008035通过海绵miR-188-3p上调HMGB2表达，来促进肺癌进程。

综上所述，新型circ_0008035/miR-188-3p/HMGB2轴在肺癌的发生中起重要作用。circ_0008035充当ceRNA，通过海绵miR-188-3p调节HMGB2影响肺癌细胞的增殖和凋亡。可见circ_0008035可能是肺癌的潜在诊断生物标志物和治疗靶标。