2型糖尿病肝脏胰岛素抵抗差异基因分析

刘志红 孟令振 刘静 鲁明 王瑞英

2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)占所有糖尿病的90%[1]，是胰岛素抵抗和胰岛素缺乏的结果，其中肝脏胰岛素抵抗是T2DM发病机制的重要组成部分[2]。目前导致肝脏胰岛素抵抗的发病机制仍有争议，不同的假设将因果关系归因于内脏脂肪、脂肪因子、内质网应激和炎症等[3]。虽然肝脏胰岛素抵抗的病理生理学是复杂和多因素的，但研究特定的分子机制可能为改善糖尿病肝脏胰岛素抵抗提供新的治疗策略。近年来，大量的基因芯片数据可以从公共数据储存库中免费获得，越来越多的研究者投入巨大的精力挖掘数据集中有价值的信息用于疾病的研究[4,5]，为糖尿病的诊断、治疗提供新的生物标志物。本研究通过生物信息学手段，从GEO数据库中寻找到关于T2DM肝脏的基因芯片数据集同时结合CTD数据库的IR相关基因，分析与肝脏IR差异表达基因(DEGs)及其通路，以期寻找到改善IR的关键靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 通过检索词“type 2 diabetes”和“hepatic”在 GEO 数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载数据集 GSE15653，该芯片数据由Pihlajamäki等[6]于 2009年4月提交，以GPL96(HG-U133A)Affymetrix Human Genome U133A Array为研究平台，分析4例2型糖尿病(GSM391707-GSM391710)及5例正常(GSM391693-GSM391697)肝脏组织的基因表达矩阵。

1.2 肝脏胰岛素抵抗差异基因筛选与可视化 利用 GEO2R在线分析工具对 GSE15653数据集样本进行分组并筛选出DEGs，以P值<0.01以及logFC绝对值≥1为筛选条件。使用ggplot2进行差异基因的可视化[7]。同时从CTD数据库中筛选出36 787个肝脏IR相关基因，CTD数据库[8]是研究人员为促进了解环境化合物对人类健康的影响构建的，为全世界的科研人员提供了集中、综合的各种不同类型分子以及来自各种生物体的毒理学数据。应用韦恩图可视化两基因集的交集基因IR-DEGs。

1.3 功能富集分析 使用R软件包clusterProfiler[9]对IR-DEGs进行基因本体论(GO)分析和京都基因与基因组数据库(KEGG)分析，同时以P<0.05为筛选条件。

1.4 蛋白互作网络构建及筛选关键基因 将上面得到的 IR-DEGs列表提交到 STRING在线数据库(https://string-db.org/)，设置最小连接评分为0.9构建蛋白质互相作用(PPI)网络图。使用 Cytoscape 3.8.0的 cytoHubba插件里的MCC算法筛选PPI网络里排名靠前的 10个基因作为关键基因。

2 结果

2.1 肝脏胰岛素抵抗差异基因 根据筛选条件，从GSE15653数据集筛选出1 233个DEGs。从CTD数据库下载IR相关基因共36 786个基因，利用Vene与GSE15653的差异基因取交集后共得到1 197个IR-DEGs，其中在GSE15653上调IR-DEGs 352 个，下调DEGs 845个。见图1。

图1 DEGs 表达谱火山图

2.2 GO 及KEGG 分析 将1 197个IR-DEGs进行GO 富集分析，GO 富集分析由生物过程(BP)、分子功能(MF)、细胞组成(CC)3个部分组成。根据 P 值排序，KEGG 通路富集分析中，DEGs 富集于磷酸戊糖途径、ErbB信号通路、MAPK信号通路、胰岛素信号通路等。见表1、2，图2。

图2 IR-DEGs的KEGG分析

表1 KEGG 分析

表2 GO分析

2.3 PPI 网络和关键基因 将1 197个DEGs提交到 STRING数据库，形成PPI 网络图。使用Cytoscape 软件选取cytoHubb的MCC 算法得到10 个关键基因:MAPK3、SRC、MAPK8、CCNB1、DLGAP5、ASPM、KRAS、NRAS、NUSAP1、BIRC5。见图3、4。

图3 PPI 网络图

3 讨论

胰岛素抵抗是指胰岛素的靶组织和细胞对其敏感性降低，是机体糖代谢紊乱的主要原因，因此对于T2DM的治疗大多关注于如何改善IR，肝脏是胰岛素在机体内起作用的重要靶器官，调控糖原的合成和糖异生的进程。肝脏IR将引起糖脂代谢紊乱以及其他病理过程的发生，因此本研究利用T2DM患者和正常人群肝脏组织样本的基因数据集，通过 GEO2R鉴定与T2DM相关上调、下调DEGs，之后与CTD数据库的IR基因取交集，得到1 197个肝脏IR-DEGs进行分析，寻找治疗肝脏IR的关键基因。

图4 关键基因；节点颜色越深代表 MCC 分值越高

GO分析发现，肝脏IR-DEGs主要富集于类固醇激素反应、Hsp90 蛋白结合、热休克蛋白绑定等。类固醇激素中的糖皮质激素可以导致肝脏IR增加[10]，体内糖皮质激素增加会升高乙酰辅酶A 羧化酶和脂肪酸合成酶的水平导致肝脏细胞脂质变性和沉积，促进炎性因子的释放，阻碍胰岛素信号通路，引起IR[11]。同时糖皮质激素可以刺激磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶基因的表达，导致肝糖异生增加，加重IR。热休克蛋白(HSPs)是一种伴侣蛋白，属于帮助受损分子恢复其功能构象的多肽家族。机体合成热休克蛋白是为了应对不同的应激源(热休克、低体温、缺氧、自由基、缺血、乙醇、紫外线辐射、病毒感染等)刺激。热休克蛋白通过减少氧化作用保护蛋白质、脂类和核酸免受损害，因此具有细胞保护作用，同时它们还调节细胞功能和基因表达，并有助于蛋白质稳态。最重要的HSP家族有HSP40、HSP60、HSP70、HSP90-kDa，以及小的热休克蛋白。研究发现DIO小鼠中的Hsp90β敲低可逆转IR并改善葡萄糖耐量[12]，在糖尿病db/db小鼠模型中长期使用HSP90抑制剂可抑制c-Jun氨基末端蛋白激酶1(JNK1)磷酸化逆转高血糖症，胰岛素敏感性得到改善[13]。研究发现HSP70在糖尿病患者的血液循环中升高，并且与疾病的慢性程度呈正相关[14]。Krause等[15]认为eHSP70/iHSP70比值可能是触发导致IR和T2DM发展的慢性促炎状态的决定性因素。但有研究发现HSP70对IR状态有有益作用，能够保护细胞免受氧化应激损伤、炎症和凋亡的损害[16]。Ohno等[17]也证实iHSP70 能够改善IR、延缓甚至逆转T2DM 疾病进程，机制与阻断JNKs抑制细胞凋亡而保护细胞相关。

KEGG分析中磷脂酰肌醇-3激酶(1-phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(Protein kinase B,Akt)通路是主要的胰岛素信号通路[18]。胰岛素与胰岛素受体结合后激活胰岛素受体底物(IRS)分子，IRS随后与PI3K结合，磷酸化Akt 增加，活化的Akt一方面促使糖原合成酶激酶-3磷酸化[19]，加速肝糖原合成; 活化的 Akt同时激活Forkhead 转录因子 1的磷酸化，抑制肝糖异生关键酶的水平，降低肝糖异生[20]; 活化的Akt 也促进葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶，加速肝脏葡萄糖的利用。在肝脏IR状态时,激活的IRS含量减少,PI3K活性下降,导致IRS/PI3K/Akt通路作用减弱,胰岛素调节糖脂代谢的信号减弱,导致代谢紊乱，加重肝脏IR，形成恶性循环。因此胰岛素信号通路在肝脏胰岛素抵抗过程中起至关重要的作用。腺苷酸活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在非胰岛素依赖的葡萄糖代谢中发挥重要作用[21]，MAPK 通过磷酸化靶蛋白来调控信号通路，促进脂肪酸氧化、抑制肝脏对糖的输出、降低脂肪生成和三酰甘油的合成，从而发挥能量代谢。MAPK可通过上调葡萄糖转运载体-4的表达，促进糖的吸收和利用，增加胰岛素受体的敏感性，改善IR[22]。

为了进一步取得与肝脏IR相关度较高的关键基因，本研究应用PPI网络筛选出MAPK3、SRC、MAPK8、CCNB1、DLGAP5、ASPM、KRAS、NRAS、NUSAP1、BIRC5这10个关键基因。SRC是一种原癌基因酪氨酸蛋白激酶，在细胞增殖、分化等细胞过程中发挥作用。Feng等[23]发现棕榈酸酯通过下调C2C12 肌管中SRC介导的Akt磷酸化导致IR。同时SRC1已被鉴定为核激素受体和其他转录因子的转录辅激活因子，SRC1基因缺失增加DKO小鼠IRS1水平，从而引起葡萄糖摄取增加和改善胰岛素敏感性，因此SRC1不仅是肥胖的潜在治疗靶点，也是糖尿病的潜在治疗靶点[24]。既往研究也发现氯沙坦通过上调SRC磷酸化水平，抑制对接蛋白1表达，增加Akt及其下游160 kDa Akt底物(AS160)的磷酸化水平，激活葡萄糖转运蛋白4的向质膜转运，增加了葡萄糖摄取，改善棕榈酸诱导的脂肪细胞IR[25]。MAPK8被称为c-Jun NH2-terminal kinase 1(JNK1)，研究发现，肥胖患者中MAPK8 mRNA水平显著升高[26]，参与肥胖诱导IR的机制，高脂肪饮食可导致小鼠JNK1信号通路激活、IR和肥胖[27]。

综上所述，关键基因MAPK3、CCNB1、DLGAP5、ASPM、KRAS、NRAS、NUSAP1、BIRC5在肝脏IR中的作用尚不清楚，这些关键基因有可能成为肝脏IR早期诊断、治疗的分子标志物，尚需后续进一步研究。