游红亮,路娜丹,汤苗苗,张蕾,刘玉峰,王叨
(郑州大学第一附属医院儿童医院 血液肿瘤科,河南 郑州 450052)
急性髓系白血病(acutemyeloid leukemia,AML)是 一种高度异质性恶性血液肿瘤,其特征为未成熟的造血祖细胞分化障碍并异常增殖。AML在儿童白血病中约占15%,既往数据显示,儿童AML诱导完全缓解率可达85% ~90%,而5 a总体生存率仅为65% ~75%,无事件生存率为50.0% ~65%[1]。细胞遗传学是AML危险度分层的常规方法,随着对AML发生机制及预后的研究,通过二代基因测序(next-generation sequencing,NGS),越来越多基因突变被发现,且部分已被纳入2017年美国国家综合癌症网络(National Comprehensive Cance Network,NCCN)指南,指导AML的分层治疗[2]。本文回顾性分析了95例初治原发儿童AML的基因突变相关临床资料,现报告如下。
1.1 一般资料收集2016年7月至2020年12月于郑州大学第一附属医院儿童医院血液肿瘤科就诊初治原发AML(非M3型)95例患者的基因突变相关临床资料,诊治依据CCLG-AML 2015方案。95例患者中男52例,女43例,男女比例1.21∶1;初诊年龄1~14岁,<2岁8例,≥2岁87例。本研究取得患者监护人的知情同意,并获得郑州大学第一附属医院医学伦理委员会批准(伦理号:2021-Y-0471)。
1.2 细胞形态学检查抽取骨髓液0.1~0.2 mL快速涂片,瑞氏染色后行细胞形态学检查,并进行过氧化物酶、糖原染色等化学染色检查。
1.3 免疫学检查抽取骨髓液2 mL于肝素钠抗凝管中,应用流式细胞仪行免疫学检查,根据CD45/SSC设门的原理区分出白血病细胞,以各抗原≥20%为阳性。
1.4 染色体核型分析抽取骨髓液3 mL于肝素抗凝管中,经24 h培养,常规方法制备染色体标本行G显带分析分裂中期细胞20个,异常染色体描述参照人类细胞遗传学国际命名体系(ISCN2013)。
1.5 融合基因检查抽取骨髓液2~3 mL,提取总RNA,反转录为cDNA,采用荧光定量PCR法检测16种融合基因CBFβ-MYH11、RUNX-RUNX1T1、MLL相关6种、TLS/ERG、DEK/CAN、BCR/ABL、SIL/TAL1、EVI1、RARA相关3种。
1.6 基因突变检查抽取骨髓液2~3 mL,分离单个核细胞,提取总DNA,采用NGS检测34种基因突变FLT3-ITD、FLT3-TDK、NRAS、KRAS、IDH1、IDH2、C-KIT、NPM1、CEBPA、DNMT3A、PHF6、TET2、ASXL1、TP53、WT-1、CBL等。
1.7 统计学方法采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析。计量资料采用中位数(范围)描述,组间比较采用非参数秩和检验;计数资料采用频数描述,组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验。采用Kaplan-Meier法进行生存分析,并利用log-rank检验比较组间生存曲线差异。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 基因突变95例患者中61(64.2%)例检测出21种基因突变,平均每人携带近1个基因突变。33(33.7%)例携带1种基因突变,28(29.5%)例携带2种及以上基因突变,其中25(25.3%)例携带2种,2(2.1%)例携带3种,1(1.1%)例携带4种。检出率以C-KIT突变最高22.1%(21/95),其他依次为CEBPA突变13.7%(16/95,单突变6例,双突变10例),NRAS突变11.6%(11/96),FLT3-ITD突变9.5%(9/95)。检出8(13.1%)例共存常见基因突变:FLT3-ITD与CEBPA突变3例,C-KIT与CEBPA、NRAS突变各1例,NRAS与FLT3-ITD、CEBPA突变各1例,FLT3-ITD、CEBPA及C-KIT突变共存1例。按基因功能分类,检出例数由高到低依次为:35(36.8%)例存在酪氨酸激酶受体基因突变,27(28.4%)例存在转录因子基因突变,22(23.2%)例存在RAS信号通路基因突变,5(5.3%)例存在组蛋白修饰基因突变,3(3.2%)例存在RNA剪切子基因突变,2(2.1%)例存在DNA甲基化基因突变。
2.2 基因突变与一般临床特征63.4%(34/52)男性患者存在基因突变,62.8%(27/43)女性患者存在基因突变。不同性别、<2岁与≥2岁组、白细胞计数(white blood cell,WBC)≤100×109L-1与>100×109L-1组、染色体正常与异常核型组基因突变患者例数差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。除CEBPA突变患者较无突变者血小板计数(platelets,PLT)较高外(P=0.043),常见基因突变与无突变患者在年龄、WBC、PLT、血红蛋白(hemoglobin,HGB)、骨髓原始细胞占比差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)。
表1 在不同性别、年龄、WBC、染色体核型组有无基因突变的例数比较(n)
表2 常见基因突变与无突变患者临床特征比较[M(范围)]
2.3 常见基因突变与FAB亚型常见基因突变在FAB亚 型 中 的 分 布 见 表3,28.1%(16/57)M2、66.7%(4/6)M4患者检测出C-KIT突变,40.0%(2/7)M1患者检测出FLT3-ITD、CEBPA突变,22.2%(2/17)M5患者检测出NRAS突变,16.7%(1/6)M7患者检测出CEBPA突变。常见基因突变在各FAB亚型中分布差异无统计学意义(χ2=13.981,P=0.158)。(25%),C-KIT突变在MLL患者中未检出。两组融合基因中常见基因突变分布差异有统计学意义(P=0.006)(表4)。EVI1及TLS/ERG融合基因患者中未检出常见基因突变。
表3 常见基因突变在FAB亚型中的分布(n)
表4 常见基因突变在染色体核型及融合基因中的分布(n)
2.4 常见基因突变与染色体核型及融合基因正常染色体核型及异常核型中均以C-KIT突变最常见,检出率分别为17.9%(7/39)、25%(14/56),但常见基因突变在两组中分布差异无统计学意义(P=0.298)。95例患者共检出核心结合因子(core binding factor,CBF)融合基因37例,其中35例RUNX-RUNX1T1,2例CBFβ/MYH11;MLL融合基因9例,EVI1融合基因4例,TLS/ERG融合基因1例。CBF融合基因患中检出常见基因突变25例,其中C-KIT突变17例(68.0%,RUNX-RUNX1T1为16例,CBFβ/MYH11为1例)、NRAS突变7例(28%)、FLT3-ITD突变1例(4%),CEBPA突变未检出。MLL融合基因患者中检出常见基因突变4例,其中CEBPA突变1例(25%)、NRAS突变2例(50.0%)、FLT3-ITD 突变1例
2.5 常见基因突变生存分析随访至2021年6月1日,中位时间16.6(1.7~59.2)个月,存活66例,总体生存率为69.5%。常见基因突变与未突变组比较发现,仅C-KIT突变为预后不良因素(P=0.021,图1),余差异无统计学意义(表5)。
表5 常见基因突变生存分析
本组AML患者基因突变检出率为64.2%(61/95),共检出21种基因突变,平均每人携带近1个基因突变,包含酪氨酸激酶受体、转录因子、RAS信号通路等多种基因,涉及造血干细胞增殖、分化、凋亡等各个环节,提示AML异质性与基因突变密切相关。基因突变共存是AML中常见现象,本组29.5%(28/95)患者携带共突变基因,8例存在常见基因共突变,以FLT3-ITD与CEBPA共突变最常见(37.5%,3/8)。二次打击学说[3]认为AML的发病是基因突变效应累积的结果,基因突变可分为Ⅰ类和Ⅱ类突变,Ⅰ类突变(FLT3、C-KIT、RAS通路等)为细胞活化相关突变,主要为激酶通路基因;Ⅱ类突变(NPM1、CEBPA、染色体易位等)主要为转录基因。Ⅱ类突变发生在疾病早期,阻断干细胞分化,Ⅰ类突变发生在后期,以促进细胞增殖。
C-KIT为酪氨酸激酶家族Ⅲ类受体基因,本组C-KIT突变率为22.1%,多见于M2、M4患者,CBF融合基因患者C-KIT突变率为68.0%。既往报道,在AML患者中C-KIT的突变率为12%,CBF融合基因患者中C-KIT突变率为12.8% ~46.1%[4],均低于本组结果;生存曲线比较发现,C-KIT突变为预后不良因素,差异有统计学意义,与报道结果[4]一致。伊马替尼、达沙替尼为C-KIT突变抑制剂,其治疗反应与长期生存率明确相关,由于D816位点突变对伊马替尼耐药[5],因此治疗前应明确突变位点,合理选择。
CEBPA为转录因子基因,转录因子网络的调节异常导致蛋白质水平的变化可影响细胞分化并促进白血病的发生。Matsuo等[6]报道315例患者中47例(14.9%)携带CEBPA突变,其中单突变26例,双突变21例,多因素分析发现CEBPA单/双突变均为无事件生存(event free survival,EFS)有利独立预后因素,且CEBPA双突变为总生存期(overall survival,OS)有利独立预后因素,这些结果表明,CEBPA突变尤其是CEBPA双突变,是儿童AML患者的一个有利独立预后因素,对风险分层治疗具有重要意义。也有研究发现,CEBPA突变与高年龄及高WBC显著相关,多见于M1、M2患者[7]。本组患者CEBPA突变率为13.7%(16/95,单突变6例,双突变10例),多见于M1患者中,与报道相近,突变者PLT较无突变者高,且突变组与未突变组生存比较无明显差异,可能与病例数相关。
NRAS为RAS通路相关基因,在AML中突变率约8%~13%,在大规模回顾性研究中均未发现NRAS突变与预后相关[8]。有研究报道,在AML具有MLL融合基因患者中,NRAS突变检出率最高达80%,此突变可使MLL细胞具有生存和增殖优势[9]。本组合并融合基因MLL的AML患者中NRAS检出率为50.0%,多见于M5患者,突变对预后无明显影响,与报道一致。
FLT3-ITD为酪氨酸激酶受体内部串联重复突变,在AML患者中突变率约10% ~15%,M1中检出率较高,为30.8%[10]。本组FLT3-ITD突变率为9.5%,M1中突变率为40.0%,与报道相似。Semary等[11]研究了687例AML患者的临床资料,其中FLT3-ITD突变71(10.3%)例,43例完全缓解,其中仅16(37.2%)例持续缓解。FLT3-ITD突变者3 a EFS和OS分别为26.9%和22.8%,接受造血干细胞移植者为77.8%和78.8%,远高于未接受造血干细胞移植者(16.3%和12.8%)。提示FLT3-ITD突变的AML患者预后差,造血干细胞移植可以改善预后,而本研究中由于病例数较少,未发现突变对预后的影响。索拉非尼为FLT3-ITD突变抑制剂,在一项随机对照研究中索拉非尼组和安慰剂组的5 a EFS分别为41%和27%,OS分别为61%和53%,这些结果证实索拉非尼在FLT3-ITD突变的AML患者中具有良好的抗白血病效应[12]。
综上所述,儿童AML中常见基因突变依次为C-KIT、CEBPA、NRAS、FLT3-ITD,C-KIT突变为预后不良因素,完善基因突变检查,有利于个体化治疗。