非小细胞肺癌癌组织和癌旁组织的环状核糖核酸表达水平与诊断价值分析

刘成英 农雪萍

江西省胸科医院病理科，江西南昌 330000

肺癌是临床常见且严重的恶性肿瘤疾病，该病的诊断率较高、致死率较高，严重危害人类的身体健康[1]。目前有研究表明，环状核糖核酸（circular ribonucleic acid，circRNA）能够明显表达出肺癌的进展情况，在高通量测序的不断更新换代下，更多的研究和文献提出circRNA 通过异常显著差异表达来表示肺癌的进展情况[2]。相关研究表明circRNA 与细胞的增殖、侵袭和分化等生物过程均有一定关系，因此了解circRNA有作为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）新生物标志物的潜能[3]。本研究分析NSCLC 癌组织和癌旁组织的circRNA 表达水平与诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年6月至2021年5月江西省胸科医院收治的12 例NSCLC 患者的病理组织标本，采集的标本需要经过冰冻切片处理，通过组织HE 染色表现出癌细胞占比≥70%；选取病理组织外侧5 cm 位置癌旁组织作为对照样本，该标本中癌细胞占比应为0，通过免疫组化ABC 染色显示阴性。其中男8 例，女4 例；平均年龄（62.64±7.62）岁；鳞癌7 例，腺癌5 例；TNM 分期：Ⅰ期5 例，Ⅱ期5 例，Ⅲ期2 例；分化程度低度8 例，中度4 例；吸烟或戒烟患者7 例，不吸烟患者5 例。收集同期47 例NSCLC 患者与47 例健康体检者血清，予以检测血清circRNA。NSCLC 患者中，男34 例，女13 例；平均年龄（61.52±6.45）岁。健康体检者中，男33 例，女14 例；平均年龄（61.38±6.67）岁。NSCLC 患者与健康体检者的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。受试者或家属签署知情同意书。纳入标准：①年龄≥18 岁；②NSCLC 患者经过病理诊断确诊[4]；③术前血常规、心电图、肝功、肾功全面检查后均符合手术标准；④健康人员无癌症病史及家族史、无放化疗史，可配合完成血清circRNA 检查。排除标准：①临床资料不全者；②TNM 分期不明确者；③合并其他恶性肿瘤者；④术前进行放化疗治疗患者；⑤治疗、检查依从性差者；⑥健康人员检查相关功能存在异常，有血清circRNA 检查禁忌。

1.2 方法

1.2.1 癌组织和癌旁组织检测 ①应用TRIzol 试剂盒（美国Thermo Fisher Scientife 公司）提取12 例患者癌组织和癌旁组织的总RNA，将RNA 置于230、260、280 nm 位置，测量吸光度数值，对浓度及纯度进行测算和评估。使用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳方法测量RNA 的纯度和完整性。②应用RNaseR（美国Epicentre 公司）排出组织中总RNA 的线性RNA。应用Super RNA Labeling（美国Arraystar 公司）将RNA 当中的cDNA 予以扩增并显示荧光。③排列杂交已经染色的组织与Human circRNA Array V2（8×15K）芯片（美国Arraystar 公司），在清洗液试剂盒（美国Agilent公司）中彻底清洗。④使用circRNA 芯片（中康博生物科技公司）予以检测、收录图像、处理数据等干预，

1.2.2 血清检测 采集NSCLC 患者及健康体检者清晨空腹肘静脉血5 ml，进行离心处理，贮存血清备用。随后使用TRIzol LS 试剂盒（美国Thermo Fisher Scientife 公司）提取血清中的总RNA。利用分光光度计测量RNA 浓度。将RNA 反转录成cDNA，将cDNA 进行荧光定量PCR。circRNA 引物为正向引物（F）：ACGAGGCATGGCCAAGATTT，反向引物（R）：TTGATACTAGAGCCCGCTGCC；GAPGH 正向引物F：GAGT CAACGATTTGGTCGT，反向引物（R）：GACAAGCTTCGCGTTCTCAG。引物序列设计和合成厂家为Cellcook（中国广州）。circRNA 的相对表达数值使用2-ΔΔCt表示。试验次数=3。

1.3 观察指标及评价标准

circRNA 癌组织和癌旁组织异常表达；circRNA聚类分析；血清circRNA 表达水平与临床指标相关性；NSCLC 的circRNA 诊断价值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，两组间比较采用χ2检验；使用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析NSCLC 患者血清circRNA 的诊断价值，计算曲线下面积（area under the curve，AUC）；利用G2505c 基因芯片扫描仪（美国Agilent 公司）扫描组织荧光情况，使用Agilent Feature software 软件分析数据，在R 平台上统一数据类型，筛选表达异常的circRNA，制作出火山图，随后进行聚类分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circRNA 癌组织和癌旁组织异常表达

在R 平台当中，通过DESeq2 软件共筛选出癌组织和癌旁组织中表达差距明显的circRNA 共194 个（癌组织表达水平：癌旁组织表达水平≥2 或≤-2），差异有统计学意义（P＜0.05）。制作出火山图（图1，封四），其中121 个显示上调（红色部分），73 个显示下调（蓝色部分）。

2.2 citcRNA 聚类分析

通过对癌组织和癌旁组织的标本中circRNA 的表达数量大小不同进行聚类分析，癌组织及癌旁组织的circRNA 表达量不同，circRNA 能够清晰分辨NSCLC 癌组织和癌旁组织。绘制聚类分析图，红色表示circRNA 表达量相对高，绿色表示表达量相对低（图2，封四）。

2.3 血清circRNA 表达水平与临床指标相关性

不同性别、年龄、吸烟情况、肿瘤分化、病理类型、癌症分期NSCLC 患者的circRNA 表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 血清circRNA 表达水平与临床指标相关性（±s）

表1 血清circRNA 表达水平与临床指标相关性（±s）

注 circRNA：环状RNA

临床特征例数circRNAt 值P 值性别0.066 0.947男女34 13 2.95±0.52 2.94±0.24年龄（岁）≤60＞60吸烟情况吸烟或戒烟不吸烟肿瘤分化中高度分化低分化病理类型鳞癌腺癌癌症分期Ⅰ～Ⅱ分期Ⅲ～Ⅳ分期0.418 0.678 16 31 3.04±0.56 2.96±0.65 1.777 0.082 25 22 3.06±0.24 2.87±0.47 0.542 0.590 31 16 2.97±0.56 2.87±0.67 0.885 0.381 26 21 3.04±0.56 2.88±0.68 0.598 0.553 28 19 2.98±0.65 2.87±0.57

2.4 血清circRNA 诊断NSCLC 的效能

NSCLC 患者的血清circRNA 表达水平高于健康体检者，差异有统计学意义（t=6.676，P＜0.001）。ROC曲线（图3）显示，血清circRNA 诊断NSCLC 的灵敏度为82.98%，特异度为61.70%，AUC=0.795（95%CI：0.682～0.879）。

图3 血清circRNA 诊断NSCLC 的ROC 曲线图

3 讨论

随着人口增长、环境变化，肺癌的发病率与死亡率也在不断升高，即便目前针对肺癌有最新研究的靶向治疗和相关的免疫疗法，但是患者的五年生存率依旧难以提升[5-6]。circRNA 是一类不具备5’末端帽子和3’末端poly（A）尾巴，内含共价键构成环形结构的非编码RNA 分子[7-8]。circRNA 能够代表一类新类型的保守内源RNA，具有调节动物基因表达的作用[9]。

本研究结果显示，NSCLC 患者癌组织和癌旁组织的异常表达的circRNA 中有121 个上调，73 个下调，提示circRNA 可能具有促进癌症发生和进展的效果。通过聚类分析来分辨癌组织和癌旁组织，可在一定程度上发挥补充火山图的优势[10-11]。此外，本研究结果还显示，NSCLC 癌组织和癌旁组织的在circRNA表达方面存在一定差异，故能够借助血清circRNA 对NSCLC 进行诊断，通过血清circRNA 对NSCLC 诊断的ROC 曲线图可见，血清circRNA 诊断NSCLC 的灵敏度为82.98%，特异度为61.70%，AUC=0.795（95%CI：0.682～0.879），提示血清circRNA 具有较高的诊断价值。

本研究推测circRNA 会促进疾病进展，并且通过癌组织的检测结果进行证明，其可信度较高。circRNA的来源主要是组织细胞坏死调往后，会通过囊泡释放到血液当中，产生循环游离的RNA，因此血清circRNA 的水平高，并且血清中的囊泡存在circRNA 的富集，因此circRNA 在癌组织以及血清当中的表达水平具有一定的相关性，今后可针对血清circRNA 的来源进行进一步探究[11-13]。因此在对NSCLC 患者进行诊断的过程中，可以通过检测血清circRNA 进行无创检查，可能会提高诊断的准确性[14]。血清circRNA 表达水平与患者临床指标相关性的结果显示，不同性别、年龄、吸烟情况、肿瘤分化、病理类型、癌症分期NSCLC 患者的circRNA 表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），原因可能是病例数过少，或者病例选择存在偏颇[15]。

综上所述，circRNA 在NSCLC 癌组织和癌旁组织的表达具有明显不同，利用血清circRNA 诊断NSCLC 的准确率较高，circRNA 水平可能在一定程度上体现病情。