QF-PCR技术中短串联重复序列杂合度分析及与染色体核型结果的比较研究

许晨霞 王德刚 张艳芳 郑国兵 彭建明

广东省中山市博爱医院产前诊断中心，广东中山 528400

胎儿染色体非整倍体是常见的染色体数目异常，其中以三体型和单体型最为常见。最常见的染色体数目异常包括21 三体综合征、18 三体综合征、13 三体综合征、三倍体和性染色体数目异常，如Klinefelter综合征（47，XXY）、Jacobs 综合征（47，XXX）、XYY 综合征（47，XYY）和Turner 综合征（45，X）等，约占产前诊断中染色体异常的80%[1]。通常有穿刺指征孕妇的胎儿染色体非整倍体风险值较高，因此需要准确性和特异性高的检测手段，以减轻孕妇的焦虑情绪，并加快干预[1]。虽然染色体核型分析一直以来被认为是诊断染色体非整倍体的金标准，但核型分析耗时耗力。QF-PCR 是一种高效、快速、可靠的产前非整倍体检测方法[2-5]。然而，由于某些短串联重复序列（short tandem repeats，STR）标记杂合度较低，这类产前样本须进一步细胞遗传学分析或者加做杂合度较高STR的位点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年9月至2021年7月在中山市博爱医院产前诊断中心进行介入性产前诊断的525 例穿刺样本作为研究对象，年龄18～47 岁，平均（32.3±5.2）岁；孕龄12～33 周，平均（18.1±3.1）周；检测标本为绒毛28例，羊水421 例，脐血76 例。产前诊断指征主要包括颈部透明层（nuchal translucency，NT）增厚（≥3.0 mm）、唐氏血清学筛查高风险、孕妇外周血胎儿游离DNA检测高风险、超声异常、夫妻双方单基因遗传病携带者等。进行介入性产前诊断的孕妇无手术禁忌证，本研究经医院医学伦理委员会审核批准，孕妇均签署知情同意书。

1.2 方法

介入性产前诊断：按照传代法细胞培养、收获、制片、G 显带进行染色体核型分析，参照人类细胞基因组学国际命名体系（2016年）进行命名。

主要仪器和试剂：多重STR 基因分型试剂盒（荧光PCR 毛细管电泳法）采购自广州市达瑞生物技术股份有限公司，共20 个STR 位点，具体见表1。标记荧光（FAM 为蓝色荧光，HEX 为绿色荧光）。ABI PCR仪2720（美国应用生物系统公司）；ABI 基因分析仪3500Dx（美国应用生物系统公司）；Lab-Aid820 核酸提取仪（厦门致善生物科技有限公司）；Pop7polymer，HiDi，SizeLizStandard600 均购LifeTechnology。

图1 QF-PCR 试剂盒中13、18、21、X、Y 染色体上STR 位点扩增序列的位置

1.3 观察指标及评价标准

QF-PCR 技术检测步骤：按照操作规范进行标本采集、提取、扩增、电泳及结果判断。每批试验均设阴性、T21 的阳性对照，操作严格试剂盒说明书进行。使用GeneMapper 5.0 软件（Applied Biosystems）对结果进行分析并计算峰面积（峰面积为特定STR 峰下的面积）。①等位基因峰1 个，即单峰，可表示1 个拷贝或两个及以上的纯和拷贝，不用于结果判断。②等位基因峰2 个，峰面积比值范围分三种情况：异常峰型（三体峰型）为1.8～2.4 或0.45～0.65；正常峰型为0.8～1.4；不能判断为正常或异常峰型即中间范围及1.4～1.8 或0.65～0.8，不用于结果判断，当该位点的判读会影响结果判断时，需重新检测分析。③等位基因峰3 个，峰面积比接近1∶1∶1（最大峰面积与最小峰面积比值范围为1～1.4），为异常峰型（三体峰型）。13、18、21 号染色体上的任意STR 位点中至少两个位点出现双峰，且峰面积比值范围为0.8～1.4 为阴性。

2 结果

2.1 STR 标记杂合度分析结果

13、18、21 及X 染色体的STR 标记中杂合度最高分别为D13S742、D18S386、D 21S1414、DXS8377；杂合度最低的分别为D13S628、D18S391、D21S1433、DXS981（表1）。

表1 STR 标记杂合度的QF-PCR 结果[n（%）]

2.2 STR 位点的峰型分析

检测到18、21 三体中均存在4 例STR 标记均为双峰。检测到的2 例18 号染色体B1～B4 的STR 标记均为单峰。检测到13、18、21 号染色体中分别有8、13、2 例STR 标记仅一个1∶1 的双峰，其余均为单峰（表2）。21 三体病例中A1-A6 的STR 标记均为2∶1或者1:2 的双峰（图2，封三）。18 号染色体的STR 标记均单峰的病例（图3，封三）。13 号染色体的STR 标记一个双峰，其他位点为单峰（图4，封三）。

表2 多重STR 分型结果（例）

图2 21 号染色体A1-A6 的STR 标记均为2∶1 或者1∶2 的双峰

图3 18 号染色体的STR 标记均为单峰

图4 13 号染色体的STR 标记1 个双峰，其他位点为单峰

2.3 QF-PCR 结果与染色体核型分析结果比较

QF-PCR 检测异常峰型三体型共27 例。QF-PCR结果与染色体核型分析结果一致。将所有位点均为单峰、只有1 个双峰其余位点均为单峰的样本进行G显带染色体核型，结果均为正常二倍体（表3）。

表3 QF-PCR 与染色体核型分析结果（例）

3 讨论

本研究使用QF-PCR 试剂盒对525 例产前样本检测的诊断率为95%，其中有25 例产前样本由于STR 位点均为单峰或者只有1 个双峰而无法判读。de Moraes 等[6]对162 个样本进行了研究，使用QFPCR 检测的诊断率为97%。Tekcan 等[7]报道的诊断率为99%。由于STR 标记存在群体差异，建议各标记应针对特定的群体进行评估[8-10]。STR 位点的杂合度分析是QF-PCR 方法进行产前诊断染色体非整倍体检测前的必要步骤[4，11]。为了在QF-PCR 非整倍体检测中获得可判断的结果，选择杂合度高的STR标记是关键步骤。杂合度分析在临床上对三体的诊断和染色体不分离的起源有重要意义[12]。本研究检测中山地区的525 份产期样本中13、18、21、X 和Y 染色体上20 个STR 标记的杂合度数据，结果显示，在13、18、21 号染色体的STR 标记中，D13S742、D18S386、D21S1414 杂合度最高，这些杂合度高的STR 标记能够作为基因指纹区分每一个个体，而杂合度过低的STR 标记则为非整倍体判读带来困难。使用含有更多其他STR 位点的试剂盒进一步检测可解决因STR 位点杂合度低而无法判读的问题[13]。当STR 位点均为单峰或者只有一个双峰，其他位点均为单峰时，很难判断该染色体该区域是否为两个拷贝。本研究进一步用G 显带染色体核型分析来确定了上述QF-PCR 结果无法判读的病例均为正常二倍体。21 三体峰全部为双峰，这类异常三体可能是由于高龄母亲生殖细胞在有丝分裂期间染色体不分离产生[14]。

有研究表明只要缺失或者重复区域包含了试剂盒设计的相邻两个STR 位点，检测结果将提示该STR 位点存在缺失或者重复[15-18]。当设计的STR 位点在染色体上距离较远时，无法得到缺失重复区域的范围大小，甚至缺失和重复区域在两个STR 位点之间时可能被漏检。本研究结果提示当研发QF-PCR 标记时，选择的STR 位点应该在整条染色体上均匀分布，且尽量选择杂合度高的STR 标记，可以根据该异常STR 标记定位到染色体的具体位置上。产前检测试剂盒设计时既要在13、18、21 及性染色体的上找到杂合度高的STR 标记，又应该考虑到STR 位点在该条染色体上均匀分布。QF-PCR 与核型分型结果一致，灵敏度高，效率高，本研究支持QF-PCR 方法用于产前检测。