金黄色葡萄球菌表面蛋白与生物被膜关系的研究进展

关晓雯 田 雨 魏莲花

1.甘肃中医药大学公共卫生学院，甘肃兰州 730000；2.甘肃省人民医院检验中心，甘肃兰州 730000

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是一种革兰氏阳性球菌，它是引起人类感染性疾病的重要病原菌之一，大约有30%的健康成年人携带SA，主要定植在皮肤和黏膜表面[1]。它不仅可以引起毛囊炎、结膜炎、肺炎等局部化脓性感染，还可以引起脓毒症、败血症等全身感染。从20世纪80年代开始，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistantStaphylococcus aureus，MRSA）在全球范围内蔓延，以至于许多国家现在报告医院中感染SA 分离株的MRSA 占比超过50%[2]。SA 的毒力因子包括黏附性分子、蛋白酶类、免疫逃逸因子和毒素类[3]，其中识别黏附基质分子的微生物表面成分是最大的一类，这些表面蛋白具有许多功能，包括黏附和侵入宿主细胞和组织，逃避免疫反应和生物膜的形成[4]。因此，细胞壁锚定蛋白是SA 在共生状态和侵入性感染期间生存的必要毒力因子。有研究表明，由SA 引起的慢性生物膜相关感染通常会导致发病率和死亡率显著增加，尤其是在与留置医疗器械相关的情况下。将生物材料植入患者体内后，机体会迅速通过由宿主来源的细胞外基质蛋白组成的调节膜将其覆盖[5]。SA 与细胞外基质蛋白的结合是由识别黏附基质分子的微生物表面成分（microbial surfaces components recognizing adhesive matrix molecules，MSCRAMMS）介导的，这些宿主蛋白质中的一些可以作为细菌附着的受体，因此显然可以在生物膜发育的早期发挥重要作用。

1 生物膜

生物膜的形成是许多细菌病原体的重要毒力机制，它可以定义为微生物来源的固着群落[6]，其典型特征是细胞附着在基质、表面或彼此之间，包埋在细胞外聚合物质的基质中，并在生长、基因表达和蛋白质产生方面表现出表型的变化[7]。虽然参与细菌生物膜形成的分子成分因细菌种类而异，但一个被广泛认可的基本模型由三个连续的阶段组成：①细菌附着于表面；②生物膜的形成和成熟；③生物膜分离和扩散[8]。为了在生物材料上形成生物膜，浮游SA 细胞首先附着在生物或非生物表面，然后增殖成称为小菌落的粘性聚集体（也称为塔或蘑菇状结构）[9]；附着到表面后，在有足够营养源的情况下，黏附的SA 开始分裂和积累，为营养物交换和废物去除提供表面积的增加，并促进生物膜细胞向远端部位的扩散[10]，这个时期，将其称之为增殖阶段；SA 生物膜的扩散在很大程度上被证明是在基因调节器（accessory gene regulator，Agr）群体感应系统的控制下进行的，活化的Agr 介导的群体感应通过蛋白酶活化和/或酚可溶性调节蛋白（phenol-soluble modulin，PSM）产生启动生物膜基质调节和细胞扩散[11]。生物膜在慢性感染的持续性中起着重要作用，它的形成会将细胞包裹在聚合物基质中，降低了对抗生素和免疫防御的敏感性，使这些感染难以根除[12]，并且在感染期间，细胞从生物膜上扩散可导致传播到次要部位，并使感染恶化。

2 表面蛋白与生物膜的关系

2.1 Ebh 蛋白和SasF 蛋白

为了在生物材料上形成生物膜，浮游SA 细胞首先利用对不同宿主基质底物特异的多种细胞壁锚定蛋白附着在表面[13]。大多数先前已经被表征的配体结合蛋白被发现与细胞壁相关，并且被称为MSCRA MMs[14]，如细胞外基质结合蛋白（extracellular matrixbinding protein homologue，Ebh）。Lei 等[15]使用蛋白质组学的方法，利用骨科植入物相关的大鼠模型，直接从感染的骨植入物中鉴定生物膜基质蛋白。结果证实，急性感染时，受感染骨组织中存在两种表面相关蛋白Ebh 和SA 表面蛋白F（surface protein ofStaphylococcus aureus，SasF）。Ebh 出现在分泌蛋白质组和表面蛋白质组的急性感染期，也出现在慢性感染期的分泌蛋白质组中；SasF 是在慢性分泌组中发现的另外一种表面蛋白。为了验证上述蛋白确实存在于感染期间的生物膜基质中，他们使用针对两种表面蛋白Ebh 和SasF 的抗体进行免疫组织化学分析[16]。结果显示，Ebh在急性和慢性感染的分泌体中均被鉴定，相比之下，SasF 仅在慢性分泌体中发现，并且Ebh 和SasF 均在感染组织中表达，而在感染其等基因突变的组织中不表达。这就意味着Ebh 和SasF 是生物膜基质的组成部分[15]。

2.2 SasG 蛋白

SA 表面蛋白G（surface protein ofStaphylococcus aureus，SasG）与表皮葡萄球菌生物膜形成所需的积累相关蛋白（biofilm-associated accumulation-associated protein，Aap）密切相关[17]。SasG 和Aap 依赖的生物膜形成是最容易理解的生物膜形成过程。Aap 可促进生物膜形成的初级附着或积累阶段[18]，具体取决于所研究的菌株。在这两种蛋白的调控下，生物膜的积累依赖于锌，锌与Aap 的G5-E 结构域结合，从而促进两个Aap 多肽的桥联[19]。此外，Aap 的G5-E 结构域会形成扭曲的绳状结构，当连接到其他细胞的Aap 蛋白质时，可以将细菌连接在一起，如图1所示。在SasG 调控的生物膜积累过程中可能会出现类似的机制[20]。

图1 CWA 蛋白在生物膜形成中的作用

2.3 FnBPs 蛋白

对于纤维连接蛋白结合蛋白（fibronectin-binding proteins，FnBPs）介导的生物膜形成，需要N2-N3 子域[21]。N2-N3 亚结构域通过对接、锁定和闩锁（dock，lock and latch，DLL）机制与配体结合。然而，DLL 不参与FnBPA 介导的生物膜，因为表达缺乏闭锁肽的FnBPA 突变株仍然形成生物膜[22]。此外，FnBPA 配体结合区域中的天冬酰胺残基对于DLL 的配体结合至关重要，可以在不减少生物膜形成的情况下进行替换[23]。FnBPs 也可以通过主要自溶蛋白（the major amidase，Atl）和替代sigma 因子（alternative sigma factors，sigB）调节的重要作用来决定生物膜的形成[24]，并且和其他表面蛋白通过嗜同性蛋白质-蛋白质相互作用或通过与邻近细胞上的其他配体结合促进聚集。这将有助于设计MRSA 生物膜形成过程中发生的蛋白质-蛋白质相互作用的抑制剂，从而降低某些疾病的发生率[25]。

2.4 ClfB 蛋白

在某些SA 菌株中，在缺乏Ca2+的条件下生长，生物膜的形成取决于聚集因子B（clumping factor B，ClfB）[26]。这是一个特别的蛋白质，因为其他生物膜介质受到Ca2+消耗的抑制，ClfB 有助于黏附和定植到鼻道中的鳞状上皮细胞[27]。在生物膜相关感染的临床分离株和SA 的实验室菌株中，生物膜相关基因的表达可能受到不同的调节因子的影响[28]。例如，MRSA 菌株通常在Agr 基因型或表型上呈阴性。此外，蛋白酶可以调节表面蛋白质依赖性生物膜的形成。ClfB 介导的生物膜形成已被证明适用于金黄色素编码基因失活的菌株，因此这种表型可能仅限于在aur 基因中存在功能缺失突变的菌株[29]。

2.5 Bap 蛋白

Bap 基因编码了一种2276 个氨基酸的新型生物膜相关蛋白（biofilm associated protein，Bap），它是第一个能够诱导生物膜形成的表面蛋白[30]。该蛋白与革兰氏阴性（铜绿假单胞菌和伤寒沙门氏菌）和革兰氏阳性（粪肠球菌）微生物的表面蛋白具有全局组织相似性[31]。Bap 的核心区域占蛋白质的52%，由13 个连续的几乎相同的重复序列组成，每个重复序列包含86 个氨基酸。所有携带Bap 的葡萄球菌菌株都具有高度的黏附性和强大的生物膜生产者[32]。而且在小鼠感染模型中，Bap 参与了发病机制，导致了小鼠机体的持续感染。Bap 是SA 副基因组的一部分，但其他葡萄球菌中Bap 的同源基因属于核心基因组。它的主要作用是促进非生物表面的黏附，并通过自组装成淀粉样聚集体诱导细胞间强烈黏附，以响应环境中的钙水平和pH 值。在感染过程中，Bap 可增强与上皮细胞的黏附力，直接与宿主受体Gp96 结合，并抑制细菌进入细胞[33]。

3 讨论

SA 和表皮葡萄球菌是难以用抗生素治疗的医疗器械相关感染的重要原因。在进化过程中，它们获得了一系列毒力特征，使其能够在生物和非生物表面定植，形成生物膜结构[34]。事实上，这是一种高度有序的结构，具有大量的蛋白质定位和组分之间的相互作用，从而形成一层坚固的保护性生物膜“涂层”[35]。其中，基质的结构成分主要是多糖和蛋白质的混合物，其中许多蛋白质已被证明能聚合成更高级的结构。SA 的纤维连接蛋白结合蛋白种类繁多，它们在定植和感染过程中扮演重要的角色，从而在宿主内表达多种功能[36]。深入了解表面蛋白介导的生物膜形成的机制基础将有助于设计与生物膜积累有关的蛋白质-蛋白质相互作用的特定抑制剂。近年来，严重生物膜感染的出现及其对抗菌治疗的耐药性给医学领域带来了巨大挑战[37]。因此，本文强调了分泌蛋白和CWA 在SA 生物膜形成和致病性中的独特作用，这可能为控制葡萄球菌生物膜感染提供理论依据和防治策略。