环境条件对Bacillus altitudinis LZP02生物膜形成的影响

黄东慧，钟 鹏，王建丽，胡云龙，王志刚，*

(1.齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省农业微生物制剂产业化技术创新中心，黑龙江 齐齐哈尔 161006；3.黑龙江省农业科学院 畜牧兽医分院，黑龙江 齐齐哈尔 161005；4.黑龙江省农业科学院 草业研究所，黑龙江 哈尔滨 150086)

细菌生物膜是指细菌通过分泌胞外聚合物形成高度组织化、系统化的膜状结构，是细菌为适应外界环境有利于存活的一种生命活动现象，其基质由胞外多糖和蛋白质组成，有助于黏附在根系表面。细菌生物膜形成主要分为黏附、积累、成熟、分散4个阶段。细菌可以借助生物膜增强自身对环境中多种胁迫的抵抗能力，对于病原菌来说，生物膜形成可以增强其对抗生素的耐受性和宿主免疫系统攻击抵抗能力。

细菌生物膜形成能力取决于营养(如二价阳离子)和环境条件(温度、pH值、盐胁迫)。较高浓度的Na或K显著抑制了BF-17生物膜的形成，同时，Ca和Mn在低浓度时促进了其生物膜的形成，但在高浓度时表现出抑制作用。在不同温度和pH值条件下，不同细菌的生物膜形成能力也不同。在对的研究中发现，ser.和的生物膜形成最适温度分别为34.5 ℃和13.0 ℃。在32 ℃、pH值7.0时MS1生物膜形成能力最强，同时，Ca、Fe、K、Na促进其生物膜的形成，Cu、Mn抑制其生物膜的形成。

植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)具有促进植物生长和拮抗土传病原菌的能力，其生物膜的形成可以保护植物根际免受土传病菌的影响，促进植物生长。LZP02是一株从水稻根际分离出的有益菌，能够定殖于根际，形成生物膜从而促进水稻生长。LZP02定殖于水稻根际时，会面临复杂的土壤环境，如温度、pH值、金属离子等。因此，本研究主要研究环境条件对LZP02生物膜形成的影响，为进一步阐明LZP02对水稻的促生机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

LZP02菌株为本实验室分离保存菌株。

LB培养基(1 000 mL)：蛋白胨10.0 g，NaCl 8.0 g，酵母膏5.0 g，pH值7.0(固体培养基加琼脂20.0 g)。

LBGM培养基(1 000 mL)：蛋白胨10.0 g，NaCl 8.0 g，酵母膏5.0 g，MnSO0.1 mmol·L，1%甘油，pH值7.0。

离子试剂：NaCl、KCl、Fe(SO)、FeSO、CaCO、MnSO、MgSO、CuSO、ZnSO

1.2 方法

1.2.1 菌株活化与培养

取-80 ℃保存的LZP02菌种在LB固体培养基上划线，置于30 ℃培养24 h。将平板中的单菌落挑出，移入100 mL LB液体培养基中，30 ℃、120 r·min振荡培养12 h。

1.2.2 菌落形态与生物膜形成观察

在4×电子显微镜下观察LZP02在LB固体培养基上培养3 d的菌落形态。移取1mL培养至=1.0的新鲜菌液，8 000×离心5 min，弃上清，用等体积LBGM培养基洗涤2次并重悬于等体积的LBGM培养基。采用96孔细胞培养板，每孔加200 μL液体，实验组为190 μ LLBGM培养基加10 μL上述菌悬液，对照组加入200 μL LBGM培养基，每个样品做3个重复。在四周培养孔加入无菌水作为保护层。置于30 ℃培养，观察成膜情况。

1.2.3 生物膜形成定量分析

首先缓慢移除孔板中的培养液，然后用无菌水清洗2～3次，洗去未黏附的菌体，室温干燥后加入体积质量0.1%的结晶紫染液染色20 min，再用无菌水冲洗5次，室温静置干燥，除去多余水分，随后加入丙酮-乙醇溶液(体积比80∶20)脱色15 min，混匀。最后用酶标仪测定在540 nm的吸光度，衡量生物膜的多少。

1.2.4 定殖分析

水稻种子用30% HO消毒30 min后，置于植物培养箱中，培养条件：光周期16 h/8 h(L/D)，温度28 ℃/18 ℃，相对湿度60%～70%。每3 d用无菌水浇灌1次，直至苗期。将培养至=1.0的LZP02培养液倒入无菌空平皿中。取长势一致的水稻幼苗，用无菌水冲洗其根部，然后将幼苗放入LZP02培养液中孵育1 h。将处理过的水稻幼苗转移到无菌MS液体培养基中，置于植物培养箱中培养，在第2天取长为1 cm的根系，分别在体积分数50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇中脱水固定30 min。使用导电黏合剂将处理过的根黏附到样品台上，通过扫描电子显微镜观察菌株在水稻根际的定殖。

1.2.5 环境因素对LZP02生物膜形成的影响

温度：菌株按1.2.2节方法处理并分别置于25、30、35、40 ℃培养箱中培养48 h，每个处理3个重复，按1.2.3节方法检测所形成生物膜的。

pH值：将LBGM培养基pH值调至3、4、5、6、7、8、9、10，按1.2.2节方法处理并置于培养箱中培养48 h，每个处理3个重复，按1.2.3节方法检测所形成生物膜的。

金属离子：在LBGM培养基中分别加入NaCl、KCl、Fe(SO)、FeSO、CaCO、MnSO、MgSO、CuSO、ZnSO。其中，Ca浓度设置为0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L，Fe浓度设置为0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L，Fe浓度设置为0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L，Mg浓度设置为0、1、2、3、4 mmol·L，K浓度设置为0、30、60、90、120、150 mmol·L，Na浓度设置为0、85、170、255、340 mmol·L，Mn浓度设置为0、1、2、3、4 mmol·L，Zn浓度设置为0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L，Cu浓度设置为0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L。按1.2.2节方法处理并置于培养箱中静置培养48 h，每个处理做5个重复。按1.2.3节方法检测所形成生物膜。

1.3 数据分析

采用SPSS 22.0(IBM，Armonk，New York，USA)进行数据分析，使用Dunnett检验确定数值差异，<0.05表示具有统计学意义。用GraphPad Prism 6软件对相关数据作图。

2 结果与分析

2.1 B. altitudinis LZP02生物膜的形成与根际定殖

在液-气和固-气表面可以观察到LZP02的生物膜结构。图1-A为LZP02在LBGM液体培养基表面逐渐形成生物膜，再慢慢分散的过程，培养24 h后，在液体表面开始观察到生物膜形成，此为生物膜形成的第一阶段，细菌黏附于液体表面。随后在36～72 h进入第二阶段，细菌逐渐形成紧密的生物膜结构。在84～96 h进入第三阶段，出现复杂的生物膜结构。在108 h后进入第四阶段，生物膜结构逐渐裂解。LZP02的菌落形态具有不同延展性的凸起褶皱结构(图1-B)，可以在水稻幼苗根际稳定定殖(图1-C)。

A，B. altitudinis LZP02生物膜形成的过程；B，B. altitudinis LZP02菌落形态；C，B. altitudinis LZP02定殖于水稻根际扫描电镜图。

2.2 温度和pH值对B. altitudinis LZP02生物膜形成的影响

温度对LZP02生物膜形成的影响如图2-A所示。由图2-A可以看出，LZP02在25 ℃生物膜形成能力弱，其他温度下均能形成生物膜。由图2-B可以看出，在30 ℃，LZP02生物膜形成能力最强。由图2-A和2-C可以看出，LZP02能够在pH值为4～10时形成生物膜，pH值为3时没有观察到生物膜形成。由图2-C可以看出，在pH值为7.0时，LZP02的生物膜形成能力最强。因此，在LBGM培养基中，LZP02生物膜形成最适温度为30 ℃，最适pH值为7.0。

柱上无相同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。

2.3 金属离子对LZP02生物膜形成的影响

由图3看出，金属离子对LZP02生物膜形成有显著影响。由图4看出，0.5～1.5 mmol·LCa对LZP02生物膜形成没有影响，而2.0 mmol·LCa对LZP02生物膜形成有抑制作用。

图3 金属离子对B. altitudinis LZP02生物膜形成的影响

图4 金属离子对B. altitudinis LZP02生物膜形成的影响

0.5～2.0 mmol·LFe、0.5～2.0 mmol·LFe、1～4 mmol·LMg、30～150 mmol·LK、85～340 mmol·LNa抑制了LZP02生物膜的形成，表现为浓度越高，生物膜形成能力越弱。添加0.5～2.0 mmol·LZn和0.5～2.0 mmol·LCu，没有观察到生物膜结构形成。1、4 mmol·LMn促进了LZP02生物膜的形成，而2、3 mmol·LMn对LZP02生物膜形成有抑制作用。

3 结论与讨论

为了在竞争根系分泌的营养物质时占优势，PGPRs首先要在植物根际稳定存活，而PGPR能否在植物根际形成生物膜决定了其在植物根际的定殖能力。本研究发现，LZP02可以在液-气和固-气表面形成生物膜。在液-气表面，24 h开始形成生物膜结构，到48 h形成紧密的生物膜结构。在固-气表面，LZP02的菌落形态呈现出明显的具有不同延展性的凸起的褶皱结构。与液-气和固-气表面生物膜的形成一致，接种水稻根际2 d后，观察到LZP02稳定定殖于水稻根际。

sp.在低营养条件(1.0～1.5 g·L蛋白胨)下，生物膜形成最适温度为30 ℃，最适pH值为6.0。HR10在37 ℃、pH值为7时其生物膜形成能力最强。本研究发现，LZP02在25～40 ℃均能形成生物膜，在30 ℃生物膜形成能力最强，在25 ℃生物膜形成能力最弱，说明低温会抑制LZP02生物膜的形成。可能是因为低温条件下，细菌的生长代谢速率下降。LZP02在pH值为7时生物膜形成能力最强，与文献报道一致；生物膜结构随酸碱度而变化，酸性或碱性环境对细菌生物膜形成有显著影响。LZP02在pH值为4～10时均能形成生物膜，表明LZP02对pH值的变化不敏感，为其在复杂的酸碱土壤环境中稳定存活提供了良好的基础。

金属离子对不同细菌生物膜形成影响不同，枯草芽孢杆菌可以吸收金属离子(Zn、Cu、Fe、Fe、Al)到生物膜基质中，从而避免不同化学环境的侵蚀。NaCl通过渗透作用对生物膜形成产生负面影响，二价阳离子(Ca、Mg)对生物膜形成有促进作用，但高浓度Ca抑制其生长，原因可能是由于细菌生长的减少促使生物膜的形成，或者是高浓度二价阳离子的存在稳定了生物膜中的胞外聚合物。也有研究表明，Ca、Mg提高了生物膜的黏附过程，进而促进生物膜形成。本研究中，K、Na对LZP02生物膜的形成表现出抑制作用，与前人研究结果一致；但是，Ca对LZP02生物膜形成没有显著影响，Mg甚至抑制LZP02生物膜的形成。细胞内铁浓度的增加可以促进SQR9生物膜基质的产生。但本研究中，Fe、Fe均抑制LZP02生物膜的形成，甚至在浓度为1.5～2.0 mmol·L时，没有观察到生物膜形成。Zn、Cu显著抑制LZP02生物膜的形成，与文献报道的高浓度的Zn、Cu影响细菌的生长相一致。Mn在4 mmol·L时促进了LZP02生物膜的形成，与文献报道一致，Mn是部分生物膜培养基的组成部分，可以促进枯草芽孢杆菌生物膜的形成。

本研究表明，LZP02具有生物膜形成能力，其形成生物膜的最适培养条件为30 ℃、pH值7；LZP02对不同金属离子的耐受性较低。