复合微生物肥料对香蕉枯萎病防控作用研究

汪军　梁昌聪　周游　王国芬　杨腊英　刘磊　黄俊生

摘 要 采用盆栽试验，研究以枯草芽孢杆菌BLG010和淡紫拟青霉E16这2株防控香蕉枯萎病的专利菌株制备的3种复合微生物肥料（CMF1、CMF2和CMF3）对香蕉枯萎病发病率、香蕉生长指标、病原尖孢镰刀菌FOC和生防菌株BLG010和E16在香蕉根际定殖情况的影响。结果表明：（1）施用CMF1、CMF2和CMF3均明显降低香蕉枯萎病的发病率，分别降至60.00%，44.44%，26.67%；（2）与对照相比，CMF1、CMF2和CMF3处理能够显著提高香蕉生物量，株高、茎围、地下部和地上部鲜重，分别提高24.46%～44.80%，40.17%～101.43%，18.78%～47.06%，75.88%～109.11%；FOC数量下降11.57%～49.07%，BLG010和E16在根际中的定殖量分别提高27.55%和32.80%；（3）共聚焦显微镜观察发现根际中尖孢镰刀菌荧光强度减弱，体积缩小；（4）相关性分析表明，香蕉枯萎病发病率与尖孢镰刀菌FOC数量呈正相关，E16菌株数量与BLG010菌株数量呈正相关。施用复合微生物肥料不仅提高了对香蕉枯萎病的防治效果，而且促进香蕉生长和提高根际的生防菌株数量，具有较大生防潜力。

关键词 淡紫拟青霉 ；枯草芽孢杆菌 ；香蕉枯萎病 ；复合微生物肥料 ；定殖

中图分类号 S432 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.08.009

Abstract Three types of compound microbial fertilizer， CMF1， CMF2 and CMF3， were prepared from Bacillus subtilis BLG010 and Paecilomyces lilacinus E16 which could control Fusarium wilt of banana， and were used for pot culture trial to observe the effect of CMF1， CMF2 and CMF3 on disease incidence of Fusarium wilt， banana growth index， and colonization of Fusarium oxysporum f. sp. cubense （FOC）， B. subtilis BLG010 and P. lilacinus E16 in banana rhizosphere. The results showed that treatments CMF1， CMF and CMF3 reduced significantly the disease incidence of Fusarium wilt to 60.00%， 44.44% and 26.67%， respectively. Compared with control， the CMF1， CMF and CMF3 treatments could promote the biomass of banana， the plant height， the stem thickness， the fresh weight of aerial and underground part of banana by 24.46%～44.80%， 40.17%～101.43%， 18.78%～47.06% and 75.88%～109.11%， respectively， reduced the number of FOC by 11.57%～49.07% and increased colonization of BLG010 and E16 in the rhizosphere by 27.55% and 32.80%， respectively. The confocal laser scanning microscope showed that the volume and the fluorescence intensity of FOC were reduced. The correlation analysis showed that the number of FOC was positively correlated with the disease incidence， and that the number of BLG010 was positively correlated with the number of E16. Compound microbial fertilizer could not only increase the controlling effect on Fusarium wilt of banana， but also promote the growth of banana and the number of antagonistic strains， indicating a wide application prospect.

Keywords Bacillus subtilis ； Paecilomyces lilacinus ； Fusarium oxysporum f. sp. cubense ； compound microbial fertilizer ； colonization

香蕉枯萎病是目前危害香蕉的一種毁灭性土传病害，病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型Fusarium. oxysporum f. sp. cubense，目前对该病的防治仍缺乏有效的方法。生物防治具有绿色、安全的优势，是近年来的研究热点[1-4]。拟青霉[5-9]和芽孢杆菌[10-15]对尖孢镰刀菌均具有拮抗活性，是防治土传病害的优良菌株。选择优质有机质等营养与高效拮抗菌株（芽孢杆菌、拟青霉等）制备复合微生物肥料，可补充生防菌在土壤中定殖所需关键营养，提高病害防控效果[1，14-16]，但是目前的研究还比较浅显。淡紫拟青霉（Paecilomyces. lilacinus）E16和枯草芽孢杆菌（B. subtilis）BLG010 2个菌株是中国热带农业科学院环境与植物保护研究所选育出的对尖孢镰刀菌具有较强拮抗作用的专利高效菌株[17-18]，同时利用BLG010菌株和E16菌株与有机质等营养制备获得的复合微生物肥料CFM已获正式登记[微生物肥（2016）准字2028号]，对枯萎病等土传病害具有较好的控制效果。本研究在此基础上通过盆栽试验比较了BLG010和E16菌株制备的复合微生物肥料（CMF1、CMF2和CMF3）对香蕉生长指标、枯萎病防治效果及病原尖孢镰刀菌FOC、生防菌株BLG010和E16在香蕉根际定殖情况等的影响，并对其作用机理进行了初步探讨，以期为复合微生物肥料的推广应用提供科学依据。endprint

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及植株

供试生防菌：淡紫拟青霉E16菌株、具有硫酸链霉素抗性的枯草芽孢杆菌BLG010菌株；供试病原菌：携带GFP标记的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种FOC由本实验室保存；供试植株：5片叶巴西香蕉苗。

1.1.2 土壤、培养基及肥料

供试健康土：未种植过香蕉的沙壤土（番木瓜土，海南儋州番木瓜基地），pH值为5.9，有机质含量22.85 g/kg，速效氮（N）含量810 mg/kg，速效磷（P）含量480 mg/kg，速效钾（K）含量7 410 mg/kg。

供试病土：接种FOC到PD液体培养基中，置于28℃、180 r/min摇床振荡培养5 d 后，于室温以10 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀物即为含孢子的菌悬液，活孢率达到5.8×108 CFU/mL。将FOC孢子悬浮液接入上述供试健康土壤中，调整土壤中FOC浓度为4.2×104 CFU/g土。

供试培养基：FOC采用尖孢镰刀菌选择性培养基[19]，E16采用选择性培养基[20]，BLG010采用含有200 μg/mL链霉素的LB培养基。

供试肥料：有机肥OF由海南宝绿春农业开发有限公司生产；3种复合微生物肥料（CMF1、CMF2和CMF3）由2株专利菌株E16和BLG010与鸡粪等有机物料通过复配制成，制备方法参考文献[21-22]及复合微生物肥料行业标准（NY/T798-2015），由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所研制，海南宝绿春农业开发有限公司生产。供试肥料基本性状见表1。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

盆栽试验：往每个塑料盆（底面直径20 cm，高30 cm）中装入500 g病土，分为5个处理：（1）对照（CK）（不施用任何物质）；（2）OF（接入3%OF，充分混匀）；（3）CMF1（接入3% CMF1）；（4）CMF2（接入3%CMF2）；（5）CMF3（接入3% CMF3）。各处理移栽香蕉苗50棵，重复3次，置于温室大棚（温度26～31℃），常规水肥管理。

1.2.2 统计方法

发病率：香蕉移苗后，每天观察香蕉生长情况，每隔20 d记录发病的植株数量，计算累积发病率。发病率/%=发病株数/（总株数）×100。

植株生长状况测定：香蕉移栽后82 d，测定株高、茎围、地上部和地下部鲜质量等生长指标，测定方法参照文献[5]。

香蕉根际病原菌FOC、生防菌BLG010和E16的数量测定：每隔20 d取根际土样1次，测定方法参考文献[5]，采用稀释涂平板法[21]，略作修改，统计FOC、E16和BLG010等土壤微生物数量。

香蕉根际病原菌FOC形态观察：取香蕉根际土样按照一定比例稀释、过滤后，浓缩离心，利用激光共聚焦显微镜（Olympus Fluoview-FV1000）观察土壤中FOC的荧光强度和形态变化。

对移栽22 、52 和82 d的香蕉枯萎病发病率与根际FOC、E16、BLG010数量进行相关性分析。

1.2.3 数据分析

试验数据利用SAS 9.0统计分析软件和Excel进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对香蕉枯萎病发病率的影响

在香蕉移植后82 d，各处理的发病率见图1。CK发病率达到96.67%，施用不含生防菌株的有机肥处理（OF）发病率为72.22%，含有菌株E16的CMF1处理的发病率为60.00%，含有菌株BLG010的CMF2处理的发病率为44.43%，含有菌株E16和BLG010的CMF3处理的发病率为26.67%，防效达到71.08%。结果表明，枯草芽孢杆菌BLG010菌株较淡紫拟青霉E16菌株能更好地防治香蕉枯萎病，尤其是2个专利菌株复配的复合微生物肥料CMF3效果最优。

2.2 不同处理对香蕉生长指标的影响

由表2可知，不同处理对香蕉生长的影响显著，与CK比较，OF显著促进了假茎围生长，而对株高、地下部和地上部重量则无明显促生作用；CMF1、CMF2和CMF3的株高、假茎围、地下部和地上部重量均有显著的提高，促生作用依次表现为CMF3>CMF2>CMF1>OF>CK。CMF1、CMF2和CMF3对株高、茎围、地下部和地上部鲜重的提高幅度分别为24.46%～44.80%、40.17%～101.43%、18.78%～47.06%、75.88%～109.11%。

2.3 不同处理对香蕉根际FOC、E16和BLG010定殖的影响

到第82天，利用不同选择性培养基检测香蕉根际病原菌FOC、生防菌E16和BLG010的菌量（Log CFU/g）。结果表明（表3），复合微生物肥料不仅能有效降低病原菌尖孢镰刀菌数量，还能提高生防菌株E16和BLG010数量；同时含有生防菌E16和BLG010的復合微生物肥料CMF3处理效果优于含有单一生防菌株E16或BLG010的复合微生物肥料处理。具体表现为：与对照比较，复合微生物肥料处理显著降低土壤中的病原菌FOC数量，以含有E16和BLG010菌株的CMF3处理效果最为显著，其次为CMF2，CMF1次之，三者对根际FOC定殖的抑制效果分别为49.07%，19.18%，11.57%。生防菌株E16和BLG010均能在土壤中保持存活，CMF3处理的香蕉根际E16定殖量比CMF1处理提高了32.80%，而其BLG010定殖量比CMF2处理提高了27.55%。

2.4 不同处理根际对尖孢镰刀菌FOC形态的影响

利用共聚焦显微镜观察的结果表明（图2），对照（CK）和有机肥OF处理中孢子形态呈椭圆形，病原菌FOC在根际以小孢子形态存在；经过3种复合微生物肥料（CMF1、CMF2和CMF3）处理的单个孢子体积减小50%以上，FOC荧光强度显著减弱，形态不规则。总体而言，经CMF1和CMF3处理后主要表现为FOC孢子体积减小，经CMF2处理后主要表现为FOC孢子边缘不规则和体积减小。endprint

2.5 香蕉根际FOC、E16和BLG010数量相关性分析

对栽培22 、52 和82 d的香蕉枯萎病发病率与根际FOC、E16、BLG010数量进行相关性分析。结果表明（表4），香蕉枯萎病发病率与FOC数量呈极显著正相关关系；E16与BLG010数量呈极显著正相关关系；其余指标间无显著相关关系。

3 讨论

淡紫拟青霉能产生类植物生长素[23]，通过营养竞争抑制病原菌生长[6]，具有防病促生作用[17，23-24]。芽孢杆菌具有分泌拮抗物质、抑制和降解病原真菌的作用[17]。本研究选用2株高效专利拮抗菌株（枯草芽孢杆菌BLG010和淡紫拟青霉E16），分别比较了单一菌株和混合菌株制备的复合微生物肥料对香蕉枯萎病的防控作用，结果发现，施用复合微生物肥料的CMF1、CMF2和CMF 3处理都明显降低了香蕉枯萎病的发病率，3个处理的发病率分别降至60.00%，44.43%，26.67%；与对照相比，CMF1、CMF2和CMF3处理能够显著提高香蕉生物量，株高、茎围、地下部和地上部鲜重的提高幅度为24.46%～109.11%，CMF3促生作用最佳，其次为CMF2、CMF1，推测功能不同的混合菌株效果优于单一菌株，而单一菌株中BLG010菌株对香蕉生长的促进效果优于E16菌株，BLG010菌株分泌拮抗促生物质的功效较E16菌株更佳，二者复配后功效最佳。

香蕉枯萎病的发生与发病程度均与根际尖孢镰刀菌数量有相关性[5，25]，生防菌成功定殖是发挥功效的前提[5，26]。因此应调控适合生防菌生长的土壤环境，提高其在土壤中的营养利用率和定殖水平，使其快速占据生态位点和分泌能有效抑制病原菌的代谢产物，从而降低土壤中尖孢镰刀菌数量，这是控制枯萎病的有效途径。本研究也发现，应用3种复合微生物肥料后，香蕉根际的病原菌FOC数量下降了11.57%～49.07%，其中CMF3效果最佳，其次为CMF2，CMF1次之；CMF3较CMF1和CMF2提高了生防菌BLG010和E16的根际定殖量，分别提高了27.55%和32.80%；首次应用共聚焦显微镜观察，直观地发现根际FOC呈现孢子畸形和体积减小，同时，相关性分析发现，香蕉枯萎病发病率与FOC数量正相关，BLG010和E16正相关。可能原因是施用复合微生物肥料后土壤有机质等营养物质含量和C/N等处于均衡状态，促进了BLG010和淡紫拟青霉E16对有机质、肥料和微量元素等营养物质的循环利用和增殖，形成优势菌群，达到竞争和分泌活性物质、抑制病原菌FOC和控制病害的目的，同时表明施用复合微生物肥料对香蕉根际病原菌、生防菌等土壤微生物种群的影响是复杂的。

单一菌株制剂或有机肥对土传病害的防治效果不稳定，难以应用于田间环境，含有拮抗菌株芽孢杆菌的生物有机肥显著降低香蕉枯萎病发病率[13，15，26]，促进香蕉生长，增加土壤细菌丰度，降低病原菌丰度[26]。本研究选择功能不同的2株高效生防菌株与有机肥等营养复配制备新型复合微生物肥料，补充生防菌株在土壤中定殖和分泌活性物质所需的关键营养，减少了病害发生，同时提供香蕉生长所需养分，与前人研究结果（生物有机肥优于传统的生防菌株制剂或有机肥）一致。本研究限于盆栽试验，田间应用效果还有待评价，同时复合微生物肥料中的淡紫拟青霉和枯草芽孢杆菌在土壤中竞争营养物质、占据生态位点和分泌抑菌物质的协同防病机理还需深入研究。

参考文献

[1] Fu L， Penton C R， Ruan Y， et al. Inducing the rhizosphere microbiome by biofertilizer application to suppress banana Fusarium wilt disease[J]. Soil Biology and Biochemistry， 2017， 104： 39-48.

[2] Beibei W， Zongzhuan S， ZHANG F， et al. Bacillus amyloliquefaciens strain W19 can promote growth and yield and suppress Fusarium wilt in banana under greenhouse and field conditions[J]. Pedosphere， 2016， 26（5）： 733-744.

[3] 周登博，井 濤，张锡炎，等. 香蕉枯萎病拮抗菌筛选及其抑菌活性[J]. 植物保护学报，2016，43（6）：913-921.

[4] 张 琳，程 萍，喻国辉，等. 枯草芽胞杆菌TR21防控粉杂1号香蕉枯萎病的效果和对根系抗性相关信号物质累积的影响[J]. 中国生物防治学报，2016，32（5）：627-634.

[5] 汪 军，王国芬，杨腊英，等. 施用淡紫拟青霉与套作对香蕉枯萎病控病作用的影响[J]. 果树学报，2013，30（5）：857-864.

[6] 刘昌燕，王国芬，梁昌聪，等. 3株真菌对香蕉枯萎病拮抗效果比较[J]. 果树学报，2010，27（6）：1 032-1 036.

[7] 李 芳，葛慈斌，刘 波， 等. 淡紫拟青霉次生代谢物质的抑菌效应[J]. 植物保护学报，2006，33（1）：94-98.

[8] Abo-Elyousr K A M， Hashem M， Ali E H. Integrated control of cotton root rot disease by mixing fungal biocontrol agents and resistance inducers[J]. Crop Protection， 2009， 28（4）： 295-301.endprint

[9] Sultana V， Ara J， Parveen G， et al. Role of crustacean chitin，fungicides and fungal antagonist on the efficacy of Pseudomonas aeruginosa in protecting chilli from root rot[J]. Pakistan Journal of Botany， 2006， 38（4）： 1 323-1 331.

[10] 薛玉潇，贾慧升，王国芬，等. 接种生防菌和病原菌对香蕉抗枯萎病的诱导[J]. 热带生物学报，2012，3（1）：62-65.

[11] 戴青冬，汪 军，邢益范，等. 两株抗香蕉枯萎病生防菌的筛选与生防效应研究[J]. 广东农业科学， 2014，41（11）：73-77.

[12] 陈平亚，汪 军，景晓辉，等. 施用枯草芽孢杆菌与覆盖对香蕉生长与枯萎病防治的作用[J]. 广东农业科学，2014，41（11）：78-81.

[13] 王国芬，汪 军，曹智淳，等. 芽胞杆菌对香蕉枯萎病的防效评价[J]. 中国农学通报，2016，32（25）：102-109.

[14] Shen Z， Wang B， Lv N， et al. Effect of the combination of bio-organic fertiliser with Bacillus amyloliquefaciens NJN-6 on the control of banana Fusarium wilt disease， crop production and banana rhizosphere culturable microflora[J]. Biocontrol Science and Technology， 2015， 25（6）： 716-731.

[15] Wang B， Yuan J， Zhang J， et al. Effects of novel bioorganic fertilizer produced by Bacillus amyloliquefaciens W19 on antagonism of Fusarium wilt of banana[J]. Biology and Fertility of Soils， 2013， 49（4）： 435-446.

[16] Wang J， Zhao Y， Ruan Y. Effects of bio-organic fertilizers produced by four Bacillus amyloliquefaciens strains on banana fusarium wilt disease[J]. Compost Science & Utilization， 2015， 23（3）： 185-198.

[17] 黄俊生，汪 军，梁昌聪，等. 一株淡紫拟青霉及其应用：中国，ZL201210358765.3[P]. 2013-10-16.

[18] 黃俊生，梁昌聪，朱利林，等. 一株枯草芽孢杆菌及其应用：中国，ZL201210248300.2[P]. 2014-04-09.

[19] 景晓辉，吴伦英，区小玲， 等. 一种简便分离香蕉枯萎病菌的选择性培养基[J]. 热带作物学报，2009，30（11）：1 671-1 673.

[20] 任文彬，蒋桂芳，张世清，等. 发酵条件对拟青霉E7菌株产脱乙酰几丁质酶的影响[J]. 农业环境科学学报，2006，25（3）：812-816.

[21] 李阜棣，喻子牛，何绍江. 农业微生物学实验技术[M]. 北京：中国农业出版社，1996：32-34，305-306.

[22] 黄俊生，汪 军，梁昌聪，等. 淡紫拟青霉的培养方法：中国，ZL 201010209110.0[P]. 2012-07-11.

[23] 夏汉祥，廖美德，周 靖，等. 淡紫拟青霉产类植物生长素的研究[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2011，39（3）：97-102.

[24] 汪 军，刘 磊，李传东，等. 淡紫拟青霉E7菌株对香蕉根结线虫的致病性和生防效果[J]. 中国植保导刊，2008，28（10）：5-8.

[25] 何 欣，黄启为，杨兴明，等. 香蕉枯萎病致病菌筛选及致病菌浓度对香蕉枯萎病的影响[J]. 中国农业科学，2010，43（18）：3 809-3 816.

[26] 袁玉娟，胡 江，凌 宁，等. 施用不同生物有机肥对连作黄瓜枯萎病防治效果及其机理初探[J]. 植物营养与肥料学报，2014，20（2）：372-379.endprint