枯草芽孢杆菌BS—8D防治玉米纹枯病的田间试验效果及作用机理

毛腾霄+叶华智+秦玉花

摘要：从玉米植株的茎基部叶鞘分离得到枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subtilis BS-8D）。田间小区防病试验结果表明，该菌株对玉米纹枯病有较好的防效。采用抗利福平标记突变菌株BS-8Drif测定其定殖能力，结果显示该菌株在玉米叶鞘上有较好的定殖能力，施用10 d后仍能保持较高密度。对BS-8D菌株拮抗机理研究发现，菌株无菌培养液能抑制玉米纹枯病菌（Rhizoctoia solani）核萌发和菌丝生长。

关键词：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；玉米纹枯病；生物防治；抗菌物质；田间试验

中图分类号：S435.131；S476+.1 文獻标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）20-5252-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.022

Abstract：Antagonistic agents of Bacillus subtilis BS-8D was isolated from the sheaths and rhizosphere of corn. The results showed that the strain BS-8D could control effectively corn sheath blight caused by the Rhizoctonia solani in field. BS-8D could colonize， propagate and remain high population at sheaths for more than ten days. The highest colonizing level was reached on 10th day after inoculation. The mechanism study of BS-8 d antagonism showed that the culture filtrate from BS-8D had a strong inhibiting activity against Rhizoctoia solani sclerotium germination and the growth of mycelia.

Key words： Bacillus subtilis； maize sheath blight； biocontrol； antagonistic substance； field experiment

玉米纹枯病主要是由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的土传病害[1-3]，该病菌侵染玉米基部叶鞘并向上部叶鞘发展，可危害茎秆和果穗，其典型症状是形成不规则的云纹状病斑，严重时造成玉米减产。该病已成为玉米上的主要病害之一。由于缺乏高抗玉米品种，生产上对纹枯病的防治主要施用井冈霉素[4]，由于防治方法单一，容易使病原菌产生抗药性[5]。因此，急需寻找其他有效、环保的防治途径。

本研究测定了枯草芽孢杆菌BS-8D菌株培养液对玉米纹枯病的田间小区防治效果，并通过该菌株在玉米叶鞘定殖的消长情况，对其作用机理作初步研究，以期为玉米纹枯病的防治提供新的方法和参考。

1 材料与方法

1.1 培养基与试剂

培养基有营养肉汤培养基（NA）、营养肉汤琼脂培养基（NA）、马铃薯葡萄糖培养基（PD）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），均由北京三药科技开发公司提供。井冈霉素5%水剂（使用时配成1 000倍稀释液），由武汉科诺生物技术股份有限公司提供。

1.2 供试材料与试验菌

供试玉米为川单15号，精选、催芽，选取发芽一致的种子备用。

拮抗菌菌液制备：菌株为四川农业大学植物病理系分离得到的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis BS-8D）。将菌株接种到营养肉汤培养基中，于35 ℃、120 r/min振荡培养72 h，制成菌体浓度约为107 CFU/mL的悬液，备用。

病原菌接种体制备：玉米纹枯病病原菌（AG1-IA）为四川农业大学植物病理系提供的强致病菌株。采用麦粒培养基，将R. solani在PDA平板上活化后，用内径5 mm打孔器打孔，将菌丝圆片接种到盛有灭菌麦粒的三角瓶中。28 ℃培养7 d左右，待菌丝在麦粒上充分生长后，作接种体用。

1.3 田间小区防病效果试验

试验设3种处理：①土壤接种病原菌处理（CK）：将病原菌麦粒接种体施入到玉米窝内土壤中，均匀分散于表层6 cm范围内，每窝15 g，播种后覆土；②土壤接种病原菌+拮抗菌菌液拌种处理（BS-8D）：接种病原菌后，种子用拮抗菌菌液拌种4 h后播种；③土壤接种病原菌+井冈霉素拌种处理（井冈霉素）：接种病原菌，种子用井冈霉素拌种后播种。每处理小区面积为6.0 m×6.0 m，重复2次。种植方式采用窝距50 cm，行距50 cm，每窝播种5粒，出苗后间苗为2 株/窝，每小区242株。试验1年1次，重复2年。

苗期处理：待玉米植株长到4叶期，各处理分别用清水、拮抗菌液和井冈霉素均匀喷施植株基部。

成株期处理：待植株生长到拔节前期和喇叭口期时，再次喷施，方法同苗期。

病情调查：待植株抽穗后，调查病斑上升的叶鞘位，按以下5级标准记载病级[6]。0级，全株不发病；1级，果穗位下第4叶鞘及以下叶鞘发病；2级，果穗位下第3叶鞘及以下叶鞘发病；3级，果穗位下第2叶鞘及以下叶鞘发病；4级，果穗位下第1叶鞘及以下叶鞘发病；5级，果穗位及以上叶鞘发病。

1.4 拮抗菌株在玉米叶鞘上的消长动态测定

1.4.1 抗药性菌株的筛选和标记 为研究拮抗菌株在田间玉米叶鞘上的消长动态，进行了抗利福平标记[7]。拮抗菌培养72 h，将菌悬液涂抹于NA平板上，在黑暗条件下用40 W紫外灯距离40 cm照射3～10 min，以95%菌体死亡为最佳处理时间。经诱变后的菌株在无光条件下培养，以后接种到含利福平的营养肉汤培养基中培养；再逐步接种到含利福平浓度逐级升高的培养基上，最后纯化培养于含300 μg/mL利福平的NA平板培养基上。挑单菌落纯化3次，选取拮抗性稳定的作为供试菌的抗利福平标记菌株。

1.4.2 标记菌株在叶鞘上的动态消长测定 取在营养肉汤培养基中培养72 h的利福平标记菌株的菌液（浓度约为107 CFU/mL），加0.1%的吐温-20（以增强展着力），喷雾接种于抽雄期玉米植株近地面健康叶鞘上，处理后1 h，取样分离作为初始菌量，以后分别在处理后2、4、6、8、10、12、16、18 d，取样分离1次，直至叶鞘表面菌量大幅下降为止。每次取样时用无菌刀片随机在各植株喷菌于叶鞘表面，共划取10块2.0 cm×3.0 cm大小的组织，剪碎后用50 mL无菌生理盐水振荡洗涤30 min，梯度稀释，取0.1 mL不同稀释度洗涤液涂布于含利福平浓度为300 μg/mL的NA平板培养基上，每稀释梯度3皿，35 ℃下培養72 h，记载菌落数。菌量用CFU/cm2表示，根据接种后测定时间和所测得的菌量绘制出标记菌株的种群消长曲线。

1.5 拮抗菌株无菌滤液对R. solani菌核萌发的影响

将已融化的琼脂均匀涂布于无菌载玻片上，待其凝固后，放在无菌培养皿内的两支玻璃棒上，每皿两片。皿内加5 mL无菌水保湿。选大小基本一致的PDA平板新培养的R. solani菌核依次经75%乙醇、0.1%升汞表面消毒5～30 s后，经无菌水洗涤，稍晾干，再于拮抗菌培养72 h的无菌滤液和营养肉汤培养基（CK）中浸润10 s，然后放在琼脂玻片上，每片5粒，粒距1.5 cm，每处理12片（60粒）。盖上培养皿盖，28 ℃培养，分别于48、72、85 h后镜检萌发情况。

萌发菌丝指数测定[8]：在玻片背面以菌核为圆心半径为2 mm划一圆圈，低倍镜下观察，自菌核长出圈外者定为萌发菌丝，萌发菌丝按以下标准分6级。0级，萌发核丝数为0；1级，萌发菌丝数为1～20；2级，萌发菌丝数为21～50；3级，萌发菌丝数为51～80；4级，萌发菌丝数为81～140；5级，萌发菌丝数≥141。按以下公式计算萌发菌丝指数。

1.6 无菌滤液对R. solani的抗生作用

将拮抗菌BS-8D培养72 h的无菌滤液按10%比例加入到无菌PD培养基中，然后接种生长旺盛的R. solani菌丝块，于28 ℃下培养8 d，挑取少许培养的菌丝，用棉蓝乳酚油染色，在光学显微镜下观察菌丝形态等特征。

2 结果与分析

2.1 田间小区防病效果

BS-8D菌株对成株期玉米纹枯病的防治效果见表1。从病情扩展速度看，BS-8D菌液处理与对照相比，病斑上升到的叶鞘位平均降低1.2 cm左右；从病情指数上看，BS-8D菌液处理低于对照，差异达显著水平，相对防效为41.12%。而BS-8D处理植株与井冈霉素处理相比，病情指数高于井冈霉素，且差异显著，其相对防效低于井冈霉素的63.01%。说明BS-8D菌株在田间具有一定的防病效果，但效果较井冈霉素仍有一定差距。

2.2 拮抗菌株在玉米叶鞘上消长动态的测定

2.2.1 抗药性菌株的筛选和标记 通过利福平从低浓度到高浓度逐级诱变及诱变后的拮抗性检测，获得了耐利福平浓度300 μg/mL的突变株BS-8Drif。

2.2.2 标记菌株在玉米叶鞘上的动态消长测定 拮抗菌BS-8Drif在田间玉米叶鞘上的定殖、消长动态见图1。接种后，叶鞘上菌量呈明显下降趋势，第4 天下降了69.7%，这段时间称为适应期。此后，菌量逐步上升，至第8天菌量达到最高，是初始带菌量的1.91倍，这段时间称为繁殖期。此后，菌量呈下降趋势。可见菌株在叶鞘表面维持较高数量可达10 d以上。

2.3 拮抗机理的探讨

2.3.1 无菌滤液对R. solani菌核萌发的影响 BS-8D无菌培养液对R. solani菌核萌发的影响见表2、图2。由表2可知，培养72 h后，菌核萌发指数和菌落直径分别比对照降低98.11%和57.41%，培养85 h后，抑制作用也十分明显，两项指标与对照相比分别降低60.04%和30.80%。由图2可以看出，菌核用BS-8D无菌滤液处理后，72 h内未观察到菌核萌发，85 h后可见少量菌丝萌发，而对照处理72 h时已大量萌发。

2.3.2 抗菌物质对R. solani的抗生作用 显微观察发现，R. solani正常菌丝为淡褐色至褐色（图3-A）。经BS-8D无菌滤液作用后的R. solani菌丝，在拮抗菌BS-8D的作用下，菌丝颜色加深，壁加厚，有些菌丝膨大内部形成球状颗粒（图3-B）；有些菌丝隔膜增加，菌丝变为椭圆形或念珠状（图3-D）；有些菌丝变粗，细胞壁被破坏，原生质外溢而造成菌丝空壳（图3-C、图3-D）；有些菌丝细胞出现畸形、裂解和断裂（图3-D）。

3 小结与讨论

本研究从玉米植株根际分离到拮抗玉米纹枯病菌的芽孢杆菌菌株BS-8D，解决了外来菌株难于在作物上定植的问题。田间小区试验、叶鞘定植试验表明，该菌株对玉米纹枯病有较好的防病效果，能在叶鞘表面定植较长时间，说明与病原菌有相似的生态适应性。采用喷施BS-8D菌悬液防治纹枯病，其防效与当前主流农药井岗霉素相比仍有一定差距，说明还需要进一步研究，如施用方式、施用浓度、有效成分、菌剂制作等。因此，未来仍需通过不同地域大面积田间试验来进一步证明其实用效果，并筛选拮抗菌田间施用的最佳浓度，在此基础上开展菌株的遗传稳定性、对人畜的安全性、菌剂的生产等方面的试验研究工作。

参考文献：

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