铁载体产生菌Paenibacillus illinoisensisYZ29在花生根际定殖能力研究

李玉菲+王梅+杜秉海+汪城墙+姚良同+丁延芹

摘要：利用绿色荧光蛋白（GFP）标记靶微生物是目前研究微生物和宿主相互作用的重要手段。在本研究中，研究者用电击转化的方法将穿梭载体pGFP4412导入铁载体产生菌伊利诺伊类芽孢杆菌（P. illinoisensis）YZ29中，并得到成功表达GFP的YZ29-gfp菌株。利用双抗平板筛选并结合荧光显微镜观察的方法检测了铁载体产生菌YZ29在花生根部及土壤中定殖情况。结果表明：标记菌株在激发光波长为488 nm的蓝光下可观察到绿色荧光；盆栽情况下YZ29-gfp可以在花生根际土和非根际土中定殖；实验室培养条件下其在花生根表定殖，在根内部没有定殖。说明，YZ29能在花生根际有效定殖，为其促生和生防作用奠定了基础。

关键词：铁载体产生菌；伊利诺伊类芽孢杆菌；花生；定殖

中图分类号：S565.2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）11-0064-05

Colonization Ability of Siderophore-Producing Bacterium

Paenibacillus illinoisensis YZ29 in Peanut Rhizosphere

Li Yufei1 ， Wang Mei2， Du Binghai1， Wang Chengqiang1，Yao Liangtong1， Ding Yanqin1

（1.Department of Microbiology，College of Life Science，Shandong Agricultural University，

Taian 271018，China；2.Taian Agricultural Bureau，Taian 271000，China）

AbstractMarking target microorganisms with green fluorescent protein （GFP） is an important means of studying the interaction between microorganisms and hosts. In this study， the shuttle vector pGFP4412 was introduced into the siderophore-producing bacterium Paenibacillus illinoisensis YZ29 by electroporation， and the YZ29-gfp strain successfully expressing GFP was obtained. The colonization of YZ29 on the peanut root surface and in the soil was studied by double-resistant plate screening combining with fluorescence microscope observation. The results showed that the green fluorescence could be observed under the blue light with excitation wavelength of 488 nm. The YZ29-gfp could colonize in the peanut rhizosphere and non-rhizosphere soils under pot culture. Under the condition of laboratory culture， it could colonize on the peanut root surface and could not colonize in the root. This showed that YZ29 could effectively colonize in the peanut rhizosphere， which layed a foundation for growth-promoting and biocontrol effects of peanut.

KeywordsSiderophore-producing bacterium；Paenibacillus illinoisensis；Peanut；Colonization

鐵载体是生长在低铁环境中的微生物合成的一种具有高Fe3+专一性的低分子量铁螯合剂[1]，其螯合的铁可以被铁胁迫条件下的植物作为铁源直接利用，还能够通过抑制病原微生物的生长而促进植物根系的抗病能力，因此在促进植物生长[2]和生物防治中有重要意义[3-5]。

花生黄化病主要是由于花生生长发育期铁、硼和锌等微量元素供应不足，抑制了叶绿素合成，影响花生光合作用，从而表现为叶片失绿症状[6]。铁载体产生菌的应用，可以有效缓解作物因缺铁引起的黄化病，从而促进植物生长，提高产量，这是一种潜在的安全、有效、经济的纠正植物缺铁性黄化病的途径。国内外相关研究工作者已经在这方面做了大量工作，例如Hordt等[7]报道称Penicillium chrysogenuma产生的铁载体混合物在碱性土壤中能提高黄瓜和玉米的叶绿素含量；Masalha等[8]研究表明，微生物铁载体与铁离子的螯合物可被处于铁胁迫下的植物作为铁源直接利用，从而改善植物的缺铁黄化症状。

在植物根系或根际土壤的有效定殖是根际促生菌发挥其促生功效的重要先决条件之一，因此研究定殖能力成为目前研究促生菌生防机理的重要内容。绿色荧光蛋白（GFP）是一种良好的标记物，可以直接、准确观测促生菌在植物根部的作用情况，被广泛应用于微生物标记，例如，刘邮洲等[9]用绿色荧光蛋白标记枯草芽孢杆菌PTS-394，研究其在番茄根部土壤中的定殖能力；郝变青等[10]采用绿色荧光蛋白标记植物促生菌B96-Ⅱ，研究表明其在黄瓜根际土壤中具有持久的定殖能力且定殖数量随土壤深度的增加而增加。伊利诺伊类芽孢杆菌YZ29是本实验室从花生根际土壤中分离的，已有研究表明，在盆栽条件下，伊利诺伊类芽孢杆菌YZ29能有效改善花生生长期内的铁营养状况，并能增强花生根系活力，促进花生植株体内氮、磷、钾的积累，从而减轻花生缺铁黄化现象和促进花生生长，大田试验中也有很好的促生和增产效果[11]。为进一步阐明其促生机理，本试验用绿色荧光蛋白GFP 对YZ29菌株进行分子标记，利用双抗平板筛选并结合荧光显微镜观察的方法，对其在花生根部的定殖情况进行初步研究。endprint

1材料与方法

1.1试验材料

菌株与质粒：伊利诺伊类芽孢杆菌YZ29由本实验室保存；芽孢杆菌与大肠杆菌穿梭载体pGFP4412由中国农业大学赠送。

植物材料：花生品种小白沙（铁敏感品种）。

抗生素：壮观霉素（Spe），工作浓度50 μg/mL，YZ29抗性；卡那霉素（Km），工作浓度50 μg/mL，质粒抗性。

主要仪器：BX51荧光显微镜，Olympus Optical；Eppendorf centrifuge 5810 离心机，Eppendorf；BD-370LT 超低温冰箱，青岛海尔股份有限公司；DNP-9162 电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；GelDoc-It 凝胶成像系统，美国UVP 公司；UV-2000 型紫外-可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；5810R 型离心机（冷冻型），德国Eppendorf 公司。

1.2试验方法

1.2.1感受态的制备挑取YZ29单菌落于50 mL LB液体培养基内，置于摇床内37℃、180 r/min培养14～16 h。取5 mL菌液加至50 mL新鲜培养基M（LB+0.5 mol/L山梨醇）内，放置于摇床内37℃、180 r/min培养。培养大约5～6 h，至OD600约为0.9，停止培养。冰上放置10 min，然后4℃、6 000 r/min离心5 min，收集菌体。用Solution A（0.5 mol/L山梨醇+0.5 mol/L海藻糖+0.5 mol/L甘露醇+10%甘油+去离子水）洗涤菌体4次。用1.2 mL Solution A重悬菌体即感受态，然后分装到小EP管内，每管60 μL菌液，-80℃保存。

1.2.2电转化装有60 μL感受态的EP管置于冰上，加入7 μL提取的质粒溶液，混匀，冰浴5 min。以上混合物转入预冷的0.1 cm的电击杯中，电压2.2 kV，电击时间4.5～5.5 ms，加入800 μL Solution B（0.5 mol/L山梨醇+0.5 mol/L海藻糖+0.38 mol/L甘露醇+LB液体）洗脱出菌体，37℃孵育3 h。涂布于含有50 μg/mL的卡那霉素抗性平板上，37℃培养2 d，挑取单菌落。荧光显微镜观察荧光现象。

1.2.3质粒检测挑取成功表达荧光的单菌落和YZ29单菌落摇菌8 h至OD600达到0.8左右，利用OMEGA EZNA plasmid mini kitⅠ试剂盒提取质粒，電压120 V凝胶电泳40 min，检测质粒提取结果，检测质粒是否成功转入荧光表达菌株。

1.2.4质粒稳定性检测挑取标记成功菌YZ29-gfp分别接种于含卡那霉素（50 μg/mL）和不含卡那霉素的10 mL液体LB培养基中，37℃、180 r/min培养，每12 h转接一次，2%的接种量接种分别转接含卡那霉素（50 μg/mL）和不含卡那霉素的液体培养基，连续摇床培养转接12次。每隔36 h取菌液平板稀释后涂布于非抗性LB平板，培养后挑取100个单菌落到含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上，培养后在荧光下统计菌落数算出菌株稳定性。质粒稳定性=可以生长的发光菌落数/100。

1.2.5不同培养条件下YZ29-gfp在花生根部定殖规律

① 盆栽试验：将花生种子用10% H2O2在暗处消毒浸泡30 min后，用水冲洗数次，种植于采自济南平阴县石灰性土壤中，每盆5粒种子，出苗后定苗，每盆两株。试验设2个处理：处理1，每株花生施用5 mL浓度为108 cfu/mL的YZ29-gfp的菌悬液；处理2，每株花生施用 5 mL无菌水。

在施菌后10、20、30、50 d时检测菌在根际土和非根际土的定殖情况。处理1称取根际土和非根际土各10 g，梯度稀释，取200 μL涂布于含50 μg/mL壮观霉素和卡那霉素的双抗平板，37℃培养48 h，根据抗性平板上生长的菌落形态和荧光显微镜下发出的荧光信号鉴定并计算菌的数量。在施菌后10、20、30、50 d时用荧光显微镜观察荧光标记成功的菌在根表的定殖，取花生根部，用无菌水冲洗干净，徒手切片，荧光显微镜观察发光情况。

②实验室培养：花生种子用10% H2O2在暗处消毒浸泡30 min，后用水冲洗数次，25℃催芽48 h，移入50 mL半固体霍格兰培养基的锥形瓶中，28℃培养。至花生出芽后分2个处理：处理1，每株苗接108 cfu/mL的YZ29-gfp菌液1 mL；处理2，接等量的无菌水。在施菌后3、7、10、15 d时取出幼苗，用无菌水清洗掉根上附着的琼脂，徒手切片，在荧光显微镜下观察。

2结果与分析

2.1荧光显微镜镜检转化子YZ29-gfp

电转后，长出菌落形态与原始菌相似但颜色略带黄绿色的菌落，gfp 可能成功导入YZ29中并成功表达转化子，命名为YZ29-gfp。将YZ29-gfp的平板置于落射式荧光显微镜下，可直接看到转化子呈现出荧光（图1A）。为进一步确认转化子，选取在落射式荧光显微镜下观察发荧光的菌落经划线纯化后，挑取单菌落并将其分散到无菌水中制成玻片，在100倍下用激发光波长为488 nm 的蓝光可观察到亮绿色的荧光（图1B），说明质粒成功转入YZ29内并成功表达绿色荧光。

2.2质粒检测

提取成功表达荧光的YZ29-gfp和YZ29质粒后，凝胶电泳检测质粒是否成功转入YZ29菌内。如图2所示，质粒大小10.7 kb左右质粒提取质量较好，这进一步证实质粒成功地转入表达荧光的YZ29菌株内。

2.3质粒遗传稳定性

标记菌株YZ29-gfp质粒稳定性试验结果表明，在没有选择压力的情况下，随着转接次数的增加，标记菌株的稳定性有降低趋势。培养液中不加卡那霉素时，菌株YZ29-gfp连续转接3次，质粒稳定性为77%，连续转接6次，质粒稳定性为零。培养液中加卡那霉素时，菌株YZ29-gfp连续转接12次，质粒稳定性为82%。可以满足定殖试验的要求。endprint