西瓜细菌性果斑病菌现场快速双模荧光RPA检测方法的建立

2022-07-28 06:47王晨薇汪小福陈笑芸徐俊锋
浙江农业学报 2022年7期
关键词:探针引物特异性

王晨薇,汪小福,魏 巍,陈笑芸,沈 洁,徐俊锋,蔡 健

(1.阜阳师范大学 生物与食品工程学院,安徽 阜阳 236037;2.浙江省农业科学院 农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室,浙江 杭州 310021;3.宁夏医科大学 临床医学院,宁夏 银川 750004)

瓜类细菌性果斑病菌是一种传播性强的细菌性种传病害,它主要为害葫芦科作物,如西瓜、甜瓜等。瓜类细菌性果斑病菌的病原为西瓜嗜酸菌(,Ac),该病害于20世纪80年代在世界范围内爆发,并传入我国,它主要由带菌种子传播,可使作物在幼苗期发病,发病时出现水渍状病斑,并通过水源、昆虫等快速侵染健康植株,使产量严重下降甚至死亡。目前尚未有可商业化的抗病品种出现,而我国又是瓜类种子(主要为西瓜、甜瓜)出口第一大国,因此,西瓜细菌性果斑病菌的检测、鉴定尤为重要。

目前,常用的病害检测方法有免疫检测与分子生物学检测。其中,免疫检测包含酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和胶体金试纸法(colloidal gold immunochromatography assay,CICA)等,但是ELISA耗时较长,灵敏度与分子检测方法相比略低,且特异性抗体的制备周期较长、较困难。胶体金试纸法耗时短,约为5~10 min,可用于现场快速检测,但灵敏度不足,也无法满足大批量样品的病害检测。分子生物学检测特别是PCR技术是现今的主流检测方法,但PCR检测需要温度梯度,循环时间较长。如赵子婧等利用微滴数字PCR对瓜类果斑病菌进行检测,灵敏度高,稳定性较好,但成本较高,对仪器要求也很高。因此,目前无论是免疫检测还是主流的PCR技术在瓜类果斑病菌的现场检测方面都存在局限性,迫切需要建立可用于现场检测果斑病的快速方法。

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是2006年发明的新型等温扩增技术,它可以在25~42 ℃恒温条件下使核酸快速扩增,形成单一的特异性产物,具有扩增快、灵敏度高、特异性强等优点。目前,RPA技术已广泛应用于细菌、病毒等的检测。Lee等利用RPA结合层析试纸条对番茄斑萎病毒进行检测,特异性良好,且灵敏度与实时荧光定量PCR(qRT-PCR)相当。Kumar等研究发现,RPA可成功地用于大量样品和体外产生的组织培养植物的检测。Miao等使用侧流试纸条对RPA扩增结果进行终点处的检测。利用层析试纸条分析RPA检测结果,一方面增加了实验成本,另一方面在检测灵敏度上有所不足,在检测过程中开盖极可能造成污染。

本研究在普通RPA中引入荧光探针,根据荧光探针的特性,一方面利用荧光仪器实时监测RPA扩增情况,另一方面在RPA扩增终端,利用蓝光照射进行可视化分析,建立了2种模式的荧光RPA分析方式。在实际样品的现场检测中,利用NaOH简化了DNA提取步骤,结合便携式荧光监测仪和蓝光灯,实现对西瓜细菌性果斑病的现场快速双模荧光检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

果斑病菌和6种葫芦科植物常见致病菌标准菌株(表1)购自河北北纳生物科技有限公司。实际检测的10个西瓜品种(S1~S10)由宁波微萌种业有限公司提供。

表1 葫芦科植物常见致病菌

1.1.2 试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)购自天根生化科技(北京)有限公司;RPA恒温快速扩增试剂盒购自安普未来生物科技有限公司(潍坊)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取与纯化

基因组DNA提取按细菌DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)操作说明进行。然后用NanoDrop 2000C核酸蛋白测定仪检测DNA的提取效果,确保其浓度与纯度,-20 ℃保存备用。

1.2.2 引物与探针设计

参考瓜类细菌性果斑病检测鉴定的国家标准(GB/T 36822—2018),利用普通PCR引物(表2)对瓜类果斑病菌的标准菌株进行qRT-PCR扩增,产物测序后进行比对,确定其为核糖体RNA间隔区序列。然后以该特异性序列为模板,利用Vector NTI软件分析选择合适的引物与探针。设计探针时用四氢呋喃(tetrahydrofuran,THF)取代第126位碱基A,分别用荧光基团和淬灭基团标记THF位点两侧第124位碱基T和128位碱基T(图1-A)。探针长度应为46~52 bp,至少有30 bp位于THF位点5′端,另外至少15 bp位于其3′端。在探针的两侧分别设计4条正反向引物,长度约为30 bp,且引物与探针的重叠部分不能延伸至荧光/淬灭基团的位置。为了避免引物-探针二聚体的出现,与探针方向相反的引物不应当有重叠。在重组酶的作用下,引物与互补序列识别,在单链结合蛋白(SSB)与Bsu聚合酶的共同作用下进行恒温扩增(图1-B)。当探针与其互补序列结合时,THF被核酸外切酶切割,荧光基团与淬灭基团分离产生荧光信号(图1-C)。具体RPA探针与引物设计原理见图1,引物与探针序列见表2。引物与探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 探针与引物

A,引物与探针序列信息;B,RPA扩增原理;C,RPA探针原理。

1.2.3 RPA反应

参照RPA反应试剂盒的说明书,反应总体系为50 μL:Buffer A 12.5 μL,正、反向引物(10 nmol·L)各2 μL,探针(10 nmol·L)0.6 μL,模板DNA(60 ng·μL)2 μL,加HO至47.5 μL,充分混匀后加Buffer B 2.5 μL。RPA反应条件:39 ℃扩增20 min。RT-RPA的扩增结果利用荧光仪器(CFX Connect荧光定量PCR仪,Bio-Rad,美国)每30 s进行1次荧光信号收集;EP-RPA的扩增结果利用手持蓝光灯(LUYOR-3415RG,路阳仪器)照射并在黄色滤镜下观察。

qRT-PCR反应体系参考国家标准(GB/T 36822—2018),扩增程序为:95 ℃ 10 min;94 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,共40个循环。

1.2.4 引物筛查

共设计了4条正向引物、4条反向引物,首先用正向引物F1分别与所有反向引物组合,结合探针对病原物DNA进行实时荧光RPA检测,选择扩增效果最佳的一条反向引物,再将其与所有正向引物组合,进行实时荧光RPA检测,选择扩增效率最高的组合作为最终的检测引物组合。

1.2.5 RPA特异性实验

以瓜类细菌性果斑病菌和其他葫芦科植物常见致病菌的基因组DNA作为模板,利用筛选到的最佳引物进行实时荧光RPA检测,以无菌水为空白对照。

1.2.6 RPA灵敏度实验

以初始浓度60 ng·μL的病原物DNA和初始浓度2.05×10CFU·mL的菌液为样本进行RPA灵敏度实验。将病原物DNA稀释为8个梯度(60、60×5、60×5、60×5、60×5、60×5、60×5、60×5ng·μL),以初始和稀释后的所有DNA为模板进行实时荧光RPA检测;将阳性菌液稀释为8个梯度(2.05×10、2.05×10、2.05×10、2.05×10、2.05×10、2.05×10、2.05×10、20.5 CFU·mL)后提取DNA,以其为模板进行实时荧光RPA检测,均用蒸馏水为对照,并将结果与qRT-PCR检测结果和蓝光照射结果进行对比。

1.2.7 实际样品的现场快速检测

将3~5粒西瓜种子放入500 μL裂解液(0.4 mol·LNaOH)中混匀浸泡2~5 min,取2 μL做为模板,利用建立好的RPA检测体系,使用手持荧光恒温扩增仪对实际西瓜样本(S1~S10)进行检测,程序运行结束后进行可视化操作,在蓝光照射下通过黄色滤镜观察,若为阳性可显出荧光。将所得结果与qRT-PCR检测结果进行对比。具体操作流程见图2。

A,将西瓜种子于裂解液中处理2~5 min,取2 μL浸出液作为模板进行RPA扩增;B,将八连管放入手持荧光恒温扩增仪中,设置程序总运行时间为25 min,10 min内即可检出;C,可视化操作。

2 结果与分析

2.1 引物筛查结果

为筛选出最优的引物对,共选用了7组引物组合,全部出现扩增曲线。图3-A为上游引物F1与所有下游引物(R1、R2、R3、R4)组合的实时荧光RPA扩增结果,F1/R2组合起峰最早,3 min左右起峰,且相对荧光强度最大,达到了2 500多,扩增效果最好。因此,选用R2与所有上游引物(F1、F2、F3、F4)组合,扩增结果见图3-B,其中F3/R2组合,虽然起峰时间不是最早,但和其他引物对相比,起峰较快且荧光值最高,因此,选用F3/R2作为瓜类果斑病菌的实时荧光RPA扩增引物。

A,上游引物F1与所有下游引物组合的扩增结果;B,下游引物R2与所有上游引物组合的扩增结果。

2.2 RPA特异性实验

为保证检测方法的特异性,在引物与探针设计的时候参考了瓜类细菌性果斑病检测鉴定国家标准(GB/T 36822—2018)中的特异性序列,从而确保了扩增区域的特异性。为了进一步验证该方法在实际检测中的特异性,对葫芦科植物常见致病菌进行了检测分析。如图4-A所示,只有Ac出现扩增曲线,其他葫芦科常见致病菌未见扩增,说明筛选出的引物与探针具有良好的特异性。荧光可视化分析结果与实时荧光扩增结果一致,含有Ac的检测管中有明亮的绿色荧光,其他检测管中未见荧光(图4-B)。

A,Ac与葫芦科植物常见致病菌DNA扩增结果;B,Ac与葫芦科植物常见病原物扩增可视化结果。Ac,西瓜噬酸菌;1~6,表1中其他致病菌;7,H2O。

2.3 RPA灵敏度与检测限

图5-A为不同浓度DNA的实时荧光RPA检测结果,起峰时间随DNA浓度降低而延长,荧光强度也随之减弱,与qRT-PCR的检测结果(图5-B)基本一致;反应结束后可视化结果见图5-C,1~8管的亮度逐渐减弱,与扩增曲线显示的结果一致。图5-D为不同浓度菌液的实时荧光RPA检测结果,前3个浓度起峰时间基本相同,可能是菌液浓度过高,提取的DNA有限导致,也可能是由于DNA浓度过高,达到了扩增阈值,其他浓度的起峰时间随菌液浓度的降低而延长,与qRT-PCR检测结果(图5-E)一致。反应结束后可视化结果见图5-F,左侧1~4管的亮度相当,之后亮度逐渐减弱,与扩增曲线显示的结果基本一致。

A,不同浓度DNA的RT-RPA检测结果;B,不同浓度DNA的qRT-PCR检测结果;C,不同浓度DNA扩增后的可视化结果(0~7的模板DNA浓度分别为60、60×5-1、60×5-2、60×5-3、60×5-4、60×5-5、60×5-6、60×5-7ng·μL-1);D,不同浓度菌液的RT-RPA检测结果;E,不同浓度菌液的qRT-PCR检测结果;F,不同浓度菌液扩增后的可视化结果(0~7的菌液浓度为:2.05×108、2.05×107、2.05×106、2.05×105、2.05×104、2.05×103、2.05×102、20.5 CFU·mL-1)。

2.4 实际样品检测结果

将实际样品的实时荧光RPA检测结果与qRT-PCR检测结果的起峰时间进行比对,结果表明(表3),RPA方法的检测均可在10 min之内完成,最快可在3 min内完成;而qRT-PCR要在30个循环左右才能检出,忽略仪器升降温的时间,最快也要40 min左右。由此可见,虽然两种方法检测结果一致,但实时荧光RPA所需检测时间比qRT-PCR短,约为qRT-PCR检测时间的1/5~1/10。扩增后的阳性样品进行蓝光照射后的荧光结果与阴性对照对比明显,S6、S8的相对荧光值最高,荧光强度和其他样品相比更强一些;S1、S2、S9的RPA结果相近,荧光亮度也差不多;S3的相对荧光值比其他几个阳性样品低,荧光强度也更弱(图6)。

表3 实际样品检测结果

图6 阳性样品检测曲线与荧光结果

3 讨论

本研究针对瓜类果斑病菌序列设计了RPA引物和探针,对引物进行筛选并进行了检测体系的特异性、灵敏度和适用性等测试,建立了瓜类细菌性果斑病的实时荧光RPA检测方法。该检测方法特异性强,灵敏度高,对极微量的DNA也能有效检出。现场对实际样品的检测能够在10 min内完成,加上制样时间也不超过15 min,是qRT-PCR检测时间的1/5~1/10,还可通过蓝光照射达到检测结果可视化的目的。该恒温、快速的检测方法为瓜类果斑病菌的现场快速检测提供了新的技术支持,并为植物病害的快速检测提供参考。

RPA是一种简单、快速、特异和敏感的核酸扩增方法,与普通PCR复杂的热循环反应相比,它可以恒温扩增,因此有助于从高级实验室到低资源外部环境的应用。但也由于它的扩增温度恒定,特异性引物与探针的设计便尤为重要。本研究上下游引物各设计了4条,并用不同的排列组合方式进行筛选,以便筛选出最优的引物组合,既方便快速又节约实验成本。目前针对普通分子实验的引物设计平台有很多,随着RPA技术的快速发展,也有必要开发针对RPA的引物设计平台。

本研究所建立的瓜类果斑病菌RPA检测体系未与其他瓜类病害发生交叉反应,特异性良好,且灵敏度与qRT-PCR的灵敏度基本一致。对不同菌落数的菌悬液进行检测发现,当菌液浓度高于2.05×10CFU·mL时,RPA检测效果无明显变化,可能与DNA提取的最大限度有关,或是达到了DNA扩增的阈值。与Walcott等进行的普通PCR检测相比,RPA检测灵敏度是其近10倍,并且无需进行凝胶电泳,避免了溴化乙锭的污染;与免疫PCR(Immuno-PCR)和qRT-PCR相比,大大节约了时间,并降低了对操作人员和实验条件的要求。

Crannell等研究表明,仅利用身体的温度,就可使RPA检测体系进行反应,但在实际的检测过程中,由于外界环境的变化,体温差异很大,而且在具体操作过程中,利用体温检测的样品量也有限。本研究利用便携式检测仪保证了RPA对温度的需要,同时提供两种观察RPA扩增结果的方式,以满足不同检测场景的需要。这种基于荧光信号的RPA检测方法,整个检测过程不需要开盖,防止了污染,同时也保证了检测灵敏度。在可视化荧光检测方面,本文利用了蓝光灯和滤镜,后续的研究考虑研发RPA扩增、蓝光照射与可视化判断的小型装置,以便更好地满足RPA现场检测的需要。

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