基于高通量测序技术分析奶牛场垫沙和橡胶垫卧床中的菌群差异

吕 倩，骆 巧，罗 雪，陈久兵，马 莉，罗正中，姚学萍，余树民，沈留红，曹随忠，*

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130；2.重庆三峡职业学院 动物科技学院，重庆 404155)

奶牛乳房炎是影响奶牛健康的主要疾病之一，患病奶牛产奶量降低，乳汁品质下降，严重影响奶牛场的经济效益和人类的食品安全。引起奶牛乳房炎的病原菌主要有传染性病原菌和环境性病原菌，传染性病原菌主要有金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、支原体等。环境性病原菌主要有大肠埃希菌、乳房链球菌、棒状杆菌等。最新研究证明，无乳链球菌等传统观念上的传染性病原菌也可能是环境性病原菌，奶牛乳房炎的问题正在由传染性乳房炎向环境性乳房炎转变。当动物机体免疫力下降时，乳房免疫系统不能抵御环境性病原菌的攻击，环境性病原菌进入乳头，最终引起乳房炎。就环境因素而言，奶牛生活环境中最常接触的便是它们的居住地-卧床垫层，那么环境性病原菌是否有可能直接来自卧床垫层？ Wu等通过对乳汁、卧床垫层、水样等进行高通量测序，结果发现，乳汁微生物菌群与卧床垫层的微生物菌群有关联。基于此，若想了解环境性病原菌是否直接来自卧床垫层，需先清楚卧床垫层的群生物菌群结构。奶牛场常见的卧床垫层为沙土垫层、橡胶垫、秸秆与木屑、牛粪垫层或生物垫层，其中沙土垫层是普遍认可的牛床垫层材料，具有清洁奶牛身体，不利于病原菌生长等优点；橡胶垫具有铺设方便、维护简单、使用方便的优点。

本研究以16S rRNA基因的V4高变区作为分子标记，利用Illumina Hiseq2500测序平台分别对四川省两规模化奶牛场的卧床垫层样本进行高通量测序，探究沙土垫层与橡胶垫层微生物菌群的结构和组成，并对两者之间的群落结构差异进行分析，旨在为奶牛场卧床垫层材料的选择以及奶牛乳房炎的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

经前期数据统计结果显示，两个奶牛场奶牛乳房炎发病时间主要集中于夏季，发病率最高月份为7—9月。故于2019年7—9月的每月最后一天从四川省成都市某规模化奶牛场(F1：总存栏荷斯坦奶牛1 500头，泌乳牛存栏1 000头，卧床垫料为风干河沙)和四川省资阳市某规模化奶牛场(F2：总存栏荷斯坦奶牛2 000头，泌乳牛存栏1 200头，卧床垫料为橡胶垫)分别随机采集泌乳牛卧床垫料混合样本，两奶牛场均为自由卧栏式牧场。卧床垫层选择标准及清洁标准见表1。在卧床清理前，使用“四点法”采集非相邻泌乳牛卧床后三分之一区域(乳房躺卧区)样本(图1)，其中：垫沙采集厚度为3 cm，样本编组为F1沙土；橡胶垫采集的样本为泥状残留物，样本编组为F2橡胶垫；各采集6份，每份50 g。所有样本置于附有冰袋的保温箱内，立即送回实验室，超低温(-80 ℃)冰箱中保存备用。在牛舍安装电子温湿度计(郑州，博洋仪器仪表有限公司)获取02:00、08:00、14:00、20:00 4个时间段牛舍内温度、湿度数据。

图1 卧床采样点分布图

表1 卧床垫层选择标准及清洁标准

1.2 细菌总DNA的提取与PCR扩增

每份垫层混合样本取300 mg，按照Meta类样本的操作步骤提取细菌的总DNA；将得到的总DNA为模板对细菌16S rRNA的V4区进行PCR扩增，扩增引物如下：515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。

1.3 高通量测序

将得到的PCR扩增产物使用1%浓度的琼脂糖凝胶在150 V电压下电泳40 min，检测合格后使用凝胶回收试剂盒回收目的片段。通过华大基因Illumina Hiseq2500测序平台进行高通量测序，获得原始数据后进行后续生物信息学分析。

1.4 生物信息学分析

使用FLASH和USEARCH软件对原始数据进行拼接过滤，得到优化序列，将相似度为97%的有效序列进行操作分类单元聚类，并挑选出相对丰度最高的序列作为每个OTUs的代表性序列。利用RDP classifer(v2.2)软件对每条代表性序列进行物种注释并构建OTUs分类信息表，绘制在属分类水平上的物种分布柱状图。选取丰度前十的物种，利用R语言绘制关键物种差异比较柱状图；计算每个试验样本的α多样性和β多样性。α多样性由反映群落丰富度的Ace指数、Chao指数及反映群落多样性的Simpson指数、Shannon指数进行评估；由于不同样本对应的数据(reads)数量差距较大，为了保证后期分析结果合理，使用R语言软件绘制Chao指数多样性稀释曲线图；β多样性选择加权遗传距离矩阵计算，并进行热图分析。

1.5 统计学分析

将所获数据先经Excel处理，再用SPSS 22.0统计软件进行统计分析，温湿度使用单因素ANOVA检验进行分析比较，物种差异分析及多样性分析使用秩和检验进行分析比较，试验结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 牛舍内温湿度参数

7—9月采样期间两奶牛场牛舍内平均温度与平均湿度如表2所示。其中，两奶牛场7月份的平均温度与平均湿度均无显著性差异(>0.05)，其他月份均存在显著性差异，故选择7月份样本进行下一步的测序分析。

表2 两奶牛场7—9月平均温度和湿度

2.2 样本测序结果

经测序，两个奶牛场的卧床垫层12个样本共获得1 499 070条原始序列，经过滤后获得1 443 818条优化序列，将相似度为97%的有效序列进行操作分类单元聚类(OTUs)，共得到2 311个OTUs(图2)，其中沙土垫层样本中特有570个OTUs，橡胶垫层样本中特有577个OTUs，两者之间共有1 164个OTUs。

图2 OTUs 维恩图

2.3 微生物群落多样性分析

2.3.1 属分类水平上物种组成分析

为了对测序所得有效序列进行物种注释，反映样本间物种的变化情况，将在属分类水平上进行菌群组成柱状图分析(图3)。结果发现，F1沙土垫层与F2橡胶垫层样本优势菌属相差较大，沙土垫层优势菌属为不动杆菌属()、海杆菌属()、里氏杆菌属()、棒状杆菌()、节杆菌属()，相对丰度分别为29.8%、13.4%、6.8%、3.6%、2.4%；橡胶垫层优势菌属为棒状杆菌属()、藤黄单胞菌属()、梭杆菌属()、盐单胞菌属()、弧菌属()，相对丰度分别为11.0%、5.2%、3.6%、3.2%、2.5%。

横坐标是样本名称(F1、F2代表场1和场2)，纵坐标是注释到的物种相对丰度。该分类水平未注释到的合并为Unclassified，丰度在所有样本均低于0.5%的物种全部合并成其他。

2.3.2 属分类水平上物种差异分析

为了研究沙土垫层与橡胶垫层样本的差异物种，选取丰度为前十的物种，展示在属分类水平上每组的平均相对丰度以及差异检验的显著性，性，进行关键物种差异比较柱状图，结果如图4所示：沙土垫层样本中不动杆菌属()、里氏杆菌属()的相对丰度显著高于橡胶垫层样本(<0.05)，橡胶垫层样本中梭杆菌属()的相对丰度显著高于沙土垫层样本(<0.05)。

横坐标是丰度为前10的物种，纵坐标是其相对丰度，*代表差异检验的显著性(如P<0.001，则用“***”标记；如0.001≤P<0.01，则用“**”标记；如0.01≤P≤0.05，则用“*”标记；如果P>0.05，则不标记)。

2.3.3 Alpha多样性分析

为了研究沙土垫层和橡胶垫层样本的微生物菌群的丰富度和多样性，对两组的Alpha多样性指数进行统计计算和差异显著性检验，结果如图5所示：Chao指数、Ace指数、Shannon指数、Simpson指数在两组之间差异均不显著(>0.05)，说明沙土垫层与橡胶垫层的微生物菌群的丰富度与多样性相似。其中两种样本的Chao指数多样性稀释曲线图趋于平缓(图6)，说明该样本的采样量足够，能覆盖大多数物种。

由下到上的五条线分别为：最小值，第一个四分位数，中位数，第三个四分位数和最大值。异常值以“。”表示。

横坐标代表测序数据量，纵坐标代表Chao指数对应的Alpha多样性指标。

2.3.4 β多样性分析

为了探究沙土垫层和橡胶垫层样本间的物种多样性差异，基于样本的 OTUs信息，计算样本之间的加权遗传距离矩阵，并进行热图分析，结果如图7所示，沙土垫层与沙土垫层、橡胶垫层与橡胶垫层的进化树距离比沙土垫层-橡胶垫层样本的进化树距离短，表明同种类型样本的相似性大于不同种类型样本，沙土样本间的菌群差异大于橡胶垫层样本。

指数越大，样本间差异越大。进化树距离越近，样本相似性越大。

3 讨论

本研究中：沙土垫层样本中不动杆菌属()、里氏杆菌属()的相对丰度显著高于橡胶垫层样本(<0.05)，橡胶垫层样本中梭杆菌属()的相对丰度显著高于沙土垫层样本(<0.05)。采样期间，两奶牛场牛舍内温度、湿度均无显著性差异，日常维护标准中仅有垫沙每日翻耕及添新沙，橡胶垫则5 a一换有差异，故引起垫沙和橡胶垫之间的微生物菌群差异的原因可能是卧床材料及更替周期的不同。

不动杆菌广泛分布于外界环境中，主要在水体及土壤中，易在潮湿环境中生存。沙土锁水能力相比橡胶垫强，故不动杆菌易在沙土中生存繁殖，引起沙土中的相对丰度显著高于橡胶垫。鲍曼不动杆菌和洛菲不动杆菌是不动杆菌属的代表菌种，均为条件致病菌。鲍曼不动杆菌不仅可致新生驹的败血症、奶牛乳房炎、水牛流产、鳜败血症，还能引起仔猪腹泻。葛东红等从江苏某奶牛场隐性乳房炎奶牛的生牛乳样品中分离出4株鲍曼不动杆菌，周文君等同样在重庆某牛场患乳房炎奶牛的乳汁分离出鲍曼不动杆菌。洛菲不动杆菌同样能够导致动物的不同感染，可引起动物感染的报道涉及犬的急性失明、新生驹败血症、鱼的内脏出血等，林杰等对29份外观正常的奶牛生乳乳样进行乳品质分析和细菌学检测，10份乳样中有4份检测出洛菲不动杆菌，且这4份乳样体细胞数偏高。故引起奶牛乳房炎的条件致病菌鲍曼不动杆菌和洛菲不动杆菌是否有可能直接来自卧床垫层，需做进一步的分离鉴定。奶牛场在选择沙土作为垫层时，在奶牛乳房炎的预防中应注意不动杆菌的预防。

在沙土和橡胶垫的优势菌属中发现：沙土垫层与橡胶垫层的优势菌属中均含有棒状杆菌属。棒状杆菌属是广泛分布于动物的微生物群(包括人类微生物群)中，大部分被认为是无害的，还有些在工业环境中是有用的，例如谷氨酸棒状杆菌。而有些可能会导致疾病。其中常见感染牛的有干燥棒状杆菌和牛棒状杆菌，Vela等从患败血症猪的内脏、患关节炎猪的关节、流产动物子宫或胎儿以及乳房炎奶牛的奶中分离出干燥棒状杆菌；牛棒状杆菌常见于奶牛乳房感染中，与奶牛产奶量减少和乳房炎有关。Wu等研究奶牛瘤胃液、粪便、乳汁、卧床垫层、水、空气中的粉尘的微生物群落多样性中，发现在自动挤奶系统中卧床垫层均存在棒状杆菌属，这与本研究结果一致，故引起奶牛乳房炎的条件致病菌如干燥棒状杆菌和牛棒状杆菌可能直接来自卧床垫层，但需进一步研究证实。奶牛场无论是选择沙土还是橡胶垫作为卧床垫层，在奶牛乳房炎的预防中均应注意棒状杆菌的预防。

引起奶牛乳房炎的环境性病原菌有大肠埃希菌、乳房链球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、牛棒状杆菌等，但在本次实验中，沙土垫层及橡胶垫层中均未发现埃希氏菌属、链球菌属、克雷伯氏菌属等，仅发现不动杆菌属和棒状杆菌属。与周德平等在肉牛发酵床上发现的优势菌属醋酸杆菌属、金黄杆菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属、乳球菌属、高温放线菌属、类芽孢杆菌属、伯克氏菌属、葡萄糖醋杆菌属有差异。分析产生差异的原因可能是卧床类型及管理的不同所造成的。下一步我们将进一步探究卧床垫层中鲍曼不动杆菌、洛菲不动杆菌、干燥棒状杆菌和牛棒状杆菌与奶牛乳房炎的关系。

Patel等研究了不同卧床垫层材料与卧床垫层细菌计数(bedding bacteria counts，BBC)、奶牛乳房卫生、奶牛乳房健康、乳汁质量间的关系，发现使用粪便固体作为卧床垫层材料，其卧床垫层细菌计数较高。Kristula等建议使用沙子作为垫层，认为沙子可以减少条件致病菌的环境定植，但同时在垫沙中也发现了高浓度的大肠埃希菌、克雷伯氏菌，这与本研究不一致，产生差异的原因是不同的卧床管理造成的。卧床管理不善往往造成卧床垫层的高细菌计数，一旦与粪便混合，任何类型的卧床都成为病原菌的来源，决定细菌浓度的是牛舍环境而不是卧床垫层类型。故无论是选择哪种类型的卧床垫层，奶牛场应格外注意卧床垫层的管理。

本研究通过对奶牛场沙土垫层与橡胶垫层微生物菌群进行高通量测序，对测序数据进行生物信息学分析，获得了沙土垫层与橡胶垫层微生物菌群分布信息，为奶牛场卧床垫层材料的选择提供参考数据，也为奶牛乳房炎的预防工作提供理论数据。

4 结论

沙土卧床与橡胶垫卧床的优势菌属差异较大，沙土垫层优势菌属为不动杆菌属()、海杆菌属()、里氏杆菌属()、棒状杆菌属()、节杆菌属(hrobacter)；橡胶垫层优势菌属为棒状杆菌属()、藤黄单胞菌属()、梭杆菌属()、盐单胞菌属()、弧菌属()。沙土垫层样本中不动杆菌属()、里氏杆菌属()的相对丰度显著高于橡胶垫层样本(<0.05)，橡胶垫层样本中梭杆菌属()的相对丰度显著高于沙土垫层样本(<0.05)，沙土垫层样本与橡胶垫层样本的丰富度与多样性相似，沙土样本间的菌群差异大于橡胶垫层样本，同种类型样本的相似性大于不同种类型样本。