掌叶覆盆子组培快繁体系中生长调节剂与矿质元素的优化

汪秀媛，邹奕巧，刘玲玲，陈 珍，江景勇

(1.台州市林业技术推广总站，浙江 台州 318000；2.台州市国土空间整治与生态修复中心，浙江 台州 318000；3.台州学院 生命科学学院，浙江 台州 318000；4.台州市农业科学研究院 园艺研究所，浙江 临海 317000)

掌叶覆盆子(Hu)，即华东覆盆子，蔷薇科悬钩子属，为我国特色的药食同源植物。成熟果实富含氨基酸、矿物质Mn和Zn、维生素C、类胡萝卜素和酚类等物质，被誉为新兴的“超级水果”。未成熟果实入药，称覆盆子，具补肾益精、养肝明目、抗菌消炎、抗氧化和抗肿瘤等多重功效，入选“新浙八味”中药材培育品种。近十年来，江苏、浙江、安徽、江西等省开始大规模种植掌叶覆盆子，面积连年攀升，2019年浙江省种植面积约达8 580 hm，占全国种植面积的一半，经济效益显著。然而掌叶覆盆子种苗来源复杂，良种短缺，种子萌发率低，枝条扦插生根难，现主要通过根蘖繁殖。繁殖系数低，成为其产业发展的主要限制因子。植物组织培养体系的建立与优化是加快覆盆子良种快繁的有效途径。前期已有学者对掌叶覆盆子的组织培养进行了初步的研究，发现利用茎段可诱导不定芽的再生与增殖。刘计权的研究结果表明，最适的诱导培养基为MS +吲哚丁酸(IBA)0.3 mg·L+ 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.5 mg·L，最佳的继代培养基为MS + IBA 0.1 mg·L+ 6-BA 1.0 mg·L+赤霉素(GA)0.05 mg·L，平均增殖系数在8以上；潘彬荣等和Zhu等则发现，最佳诱导培养基为MS + 6-BA 1.5 mg·L+萘乙酸(NAA)0.2～0.3 mg·L，最适分化培养基为MS + 6-糠氨基腺嘌呤(KT)2.0 mg·L+ NAA 0.4～0.5 mg·L，增殖达3.6～4.2倍。本课题组前期以浙江省台州市的掌叶覆盆子当年生茎段为外植体，建立了快繁体系，最佳诱导培养基和继代培养基分别为MS + 6-BA 0.5 mg·L+NAA 0.01 mg·L和MS+6-BA 1.0 mg·L+NAA 0.1 mg·L，增殖系数可达15.1。但是掌叶覆盆子幼苗继代培养容易发生生长退化和玻璃化现象，严重影响增殖和生根。因此，本文在前期工作的基础上，优化研究植物生长调节剂配比对掌叶覆盆子增殖和组培苗生长的影响，并改变营养元素的浓度，以获得最佳的组培苗生长配方，加快实现生物技术规模化繁育掌叶覆盆子良种。

1 材料与方法

1.1 材料

经过引种驯化、物候期观察、营养和药用成分测定，从上万株野生掌叶覆盆子(Hu)植株中选育到近20个优质株系，种植在浙江临海的试验基地(28°73′39″N，121°09′11″E)。其中，优株L14具中熟、生长势旺、总萜和山奈酚-3--芸香糖苷含量较高等特点，已在前期初步建立了组织培养体系。

1.2 方法

1.2.1 掌叶覆盆子不定芽的诱导

取掌叶覆盆子植株的当年生幼嫩枝条，流水冲洗1～2 h，70%乙醇浸泡30 s，0.1% HgCl消毒10 min，无菌水冲洗5遍。将外植体切成1～2 cm的带节茎段，接种到诱导培养基MS + 6-BA 0.5 mg·L+NAA 0.1 mg·L(蔗糖3%，琼脂7%～8%，pH值5.8，下同)上。于培养室中培养，光强为4 000～5 000 lx，12 h·d，培养温度为(23±2)℃。下同。待腋芽长至1～2 cm时切下，接种到MS + 6-BA 1.0 mg·L+ NAA 0.1 mg·L中扩大培养1代，获得丛生芽，分离单株继续以下增殖配方优化研究。

1.2.2 6-BA和KT配比对掌叶覆盆子组培苗增殖生长的影响

以MS为基本培养基，添加0.1 mg·LNAA，并设置不同的6-BA和KT配比(各0、0.05、0.1、0.5和1.0 mg·L)，共25个组合，设4个重复，共计20个外植体。培养45 d后，统计增殖系数，并观察组培苗质量。增殖系数=每个外植体基部新长出的不定芽数量/外植体数量。

1.2.3 6-BA或KT对掌叶覆盆子组培苗增殖生长的影响

为阐明6-BA和KT的作用强度，将6-BA设置0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和3.0 mg·L8个浓度梯度，将KT设置0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和30.0 mg·L8个梯度，分别加入MS基本培养基中，并添加0.1 mg·LNAA。设4个重复，共计20个外植体。培养30 d后，统计增殖系数，观察组培苗质量。

1.2.4 矿质元素对掌叶覆盆子组培苗生长的影响

研究MS培养基中大量元素Ca和Mg、掌叶覆盆子偏好的微量元素Mn、Zn和Cu元素对掌叶覆盆子组培苗增殖生长的影响。以MS基本培养基+ 6-BA 0.5 mg·L+ KT 1.0 mg·L+ NAA 0.1 mg·L为对照组，其中，CaCl·2HO为440 mg·L，MgSO·7HO为370 mg·L，MnSO·HO为16.9 mg·L，ZnSO·7HO为10.6 mg·L，CuSO·5HO为0.025 mg·L。在此基础上，改变上述5种营养元素的浓度，分别设置1/4、1/2、2和4倍强度。每培养瓶中添加30 mL培养基，高压灭菌。设4个重复，共计20个外植体。培养45 d后，统计增殖系数，观察组培苗质量。

1.3 数据处理

数据以平均值±标准差表示，并用SPSS20.0软件作单因素方差分析(LSD法)。

2 结果与分析

2.1 6-BA和KT组合对掌叶覆盆子组培苗增殖的影响

6-BA为0～1.0 mg·L时，随着6-BA体积质量的增加，掌叶覆盆子组培苗增殖系数增加(表1)。0.05和0.1 mg·L6-BA不能促进芽增殖，苗生长细弱，黄化并趋于玻璃化；此时添加0.5～1.0 mg·LKT可促进苗生长。当6-BA为0.5 mg·L时，增殖系数显著增加至5.33，仍伴有轻微玻璃化，此时添加0.1～1.0 mg·LKT，可消除玻璃化现象，苗生长健壮。0.5 mg·L6-BA和1.0 mg·LKT组合时，增殖系数达到最大，每个外植体可新生10.33株幼苗。当6-BA继续增加至1.0 mg·L时，增殖系数为7.89，但玻璃化程度加剧；添加0.5～1.0 mg·LKT也可有效减轻玻璃化(表1)。另一方面，单独添加0～1.0 mg·LKT不能促进掌叶覆盆子组培苗的增殖，但随着体积质量的增加，可有效促进苗的生长，幼苗叶片深绿(表1)。MS + 6-BA 0.5 mg·L+ KT 1.0 mg·L+ NAA 0.1 mg·L为优化后的掌叶覆盆子增殖培养基配方，平均增殖系数达10.33，且苗生长健壮，能有效抑制玻璃化的产生。

表1 6-BA和KT组合对掌叶覆盆子组培苗增殖生长的影响

2.2 掌叶覆盆子组培苗增殖培养时6-BA或KT的浓度效应

低浓度的KT不利于掌叶覆盆子组培苗增殖，不断提高其浓度至30 mg·L，发现KT对掌叶覆盆子增殖的影响存在浓度效应，且与6-BA浓度效应相关联。即，当KT达到6-BA体积质量的10倍时，其对组培苗增殖的影响与6-BA相当(表2，图1)。6-BA为0.01～0.1 mg·L或KT为0.10～1.0 mg·L，均不能促进掌叶覆盆子幼苗的增殖。当6-BA增加至0.5～1.0 mg·L或KT增加至5.0～10.0 mg·L幼苗增殖系数显著增加且效果相当，但是KT处理的幼苗生长优于6-BA处理的幼苗，玻璃化现象消除，叶片深绿。当两者浓度继续增加时，都会出现严重的玻璃化。因此，掌叶覆盆子组培时，单独添加6-BA或KT宜分别控制在0.5～1.0 mg·L或5.0～10.0 mg·L。

图1 KT与6-BA对掌叶覆盆子增殖培养的影响

表2 6-BA或KT对掌叶覆盆子组培苗增殖生长的影响

2.3 矿质元素质量对掌叶覆盆子组培苗生长的影响

MS培养基中矿质元素对掌叶覆盆子增殖生长的影响结果见表3。适当提高Ca浓度有利于促进覆盆子组培苗的生长，但对增殖系数没有显著影响。2倍的MS Ca即(880 mg·LCaCl·2HO)为最适的Ca离子体积质量。低浓度的Mg可满足掌叶覆盆子组培苗的生长需求，并且能提高增殖系数，高浓度的Mg会抑制组培苗的生长，因此可添加1/4 MS Mg(即92.5 mg·LMgSO·7HO)。对于微量元素，适当提高Cu和Mn浓度可以促进掌叶覆盆子组培苗的生长，因此，培养基中可添加2倍的MS Cu(即0.050 mg·LCuSO·5HO)和MS Mn(即33.8 mg·LMnSO·HO)。而MS中Zn浓度减半(即5.3 mg·LZnSO·7HO)更利于掌叶覆盆子组培苗生长。因此，后续的培养中，以改良的MS培养基添加2倍MS Ca、1/4 MS Mg、2倍MS Cu、2倍MS Mn和1/2 MS Zn为优化后的掌叶覆盆子增殖培养基，获得的幼苗增殖良好，生长健壮，生根良好。

表3 矿质元素质量浓度对掌叶覆盆子组培苗增殖生长的影响

3 结论与讨论

组培苗玻璃化是工厂化育苗的一大障碍。培养基中的细胞分裂素类物质种类和浓度对玻璃化有显著影响。研究表明，随着6-BA浓度的增加，玻璃化苗比例呈递增趋势。这可能是因为高浓度的6-BA导致组培苗内源激素比例失调造成的。高红兵等检测发现，酸樱桃()玻璃化苗芽中吲哚乙酸(IAA)和赤霉素(GA)含量基本不变，而玉米素(ZR)含量远远低于正常苗，从而影响组培苗的正常生长，出现维管束发育不全、栅栏组织和角质层蜡质缺失等现象。在掌叶覆盆子增殖培养过程中，组培苗的玻璃化现象也随6-BA浓度的增加而加剧，因此6-BA应控制在0.5～1.0 mg·L；此时，添加0.1～1.0 mg·LKT可促进幼苗的生长，尤其是1.0 mg·LKT，可有效消除玻璃化现象的产生，促进苗的健壮生长。可见，KT的加入与6-BA之间产生了一定的互补效应，不但促进组培苗的生长与增殖，且能有效减轻玻璃化，其内在机制仍需深入研究。

不同种类细胞分裂素对悬钩子属植物组培苗生长和增殖的影响不同，相同浓度的KT和6-BA促进增殖的效果不同。KT为1.0～2.0 mg·L时，不能满足树莓()Kivigold试管苗的增殖需求，增殖系数为1.0；而6-BA为1.0～2.0 mg·L时，增殖系数增加至4.9～4.2，显著大于KT处理组。本研究结果也表明，0.5～2.0 mg·LKT不能促进掌叶覆盆子组培苗增殖，而0.5～2.0 mg·L6-BA处理下增殖系数达5.0～6.0。可见，在0.5～2.0 mg·L时，6-BA的作用效果显著优于KT。然而继续扩大KT和6-BA的浓度范围，发现当KT增至5.0～10.0 mg·L时，增殖系数迅速增加，苗生长健壮。并且有意思的是，当KT体积质量为6-BA的10倍时，增殖效果相当，且苗的生长优于6-BA处理。可见，合适浓度KT也适合悬钩子属植物组织培养。

培养基中元素含量的改变也会显著影响组培效果。Poothong等研究了大量元素质量浓度改变对红树莓()组织培养的影响，提出2.5～3.0倍浓度的MS CaCl、MgSO和KHPO更适合所试5种红树莓的培养。杨琼芬等在马铃薯脱毒快繁研究时发现，P、Ca、Mg的加量能促进组培苗的生长。本试验研究也表明，低浓度的Ca会引起掌叶覆盆子试管苗的玻璃化，2倍浓度的MS Ca可促进试管苗的健壮生长。究其原因，Ca和B起细胞结构稳定作用，缺Ca会引起木质素和纤维素含量下降，影响细胞壁形成并出现玻璃化。此外，Mg、Mn、Zn和Cu参与叶绿素的形成、参与电子传递或是呼吸酶的组成部分，影响植物的光合能力和呼吸作用，其含量也会影响组培苗的生长。而不同植物或同一植物不同基因型对元素的响应各异，因此需在育苗时针对培养材料进行细致的优化，以获得最佳的培养效果。对掌叶覆盆子优株L14而言，2倍浓度的MS Ca、1/4浓度的MS Mg、2倍浓度的MS Cu、2倍浓度的MS Mn和1/2浓度的MS Zn更适合试管苗的增殖和生长。

综上，本文从植物生长调节剂的组合、质量浓度与矿质元素含量3方面优化了掌叶覆盆子的组培快繁配方，结果表明，单独添加0.5～3.0 mg·L6-BA会引起试管苗的玻璃化，且随浓度增加而加剧，添加0.1～1.0 mg·LKT可有效缓解玻璃化发生；5.0～30.0 mg·LKT促进掌叶覆盆子组培苗增殖的效果与0.5～3.0 mg·L6-BA相当，可见6-BA的作用强度约为KT的10倍；调整矿质元素含量可使组培苗生长更为健壮。因此，改良的MS培养基(2倍浓度的Ca、Cu和Mn含量，1/4 Mg和1/2 Zn含量)+ 6-BA 0.5 mg·L+ KT 1.0 mg·L+ NAA 0.1 mg·L为优化后的掌叶覆盆子增殖培养基配方，增殖系数达10.33，且苗生长健壮，有效抑制了玻璃化的产生。