4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷的合成研究

党济政 易 莉

1.重庆医科大学附属大学城医院药学部，重庆 401331；2.重庆市万州中心血站检验科，重庆 404000

糖作为三大营养物质之一在人体中承担着非常重要的角色，而很多糖苷类化合物具有特殊的生物活性，如抗菌性、抗病毒和抗肿瘤活性[1]。β-半乳糖苷酶是指一类水解含半乳糖苷键物质的酶类，现今该酶在生物技术领域如基因工程、酶工程、蛋白质工程等方面也都发挥着重要作用，并开始广泛应用于医药等领域。β-半乳糖苷类化合物是β-半乳糖苷酶水解的底物，通过该酶-底物水解反应过程可测定酶活性，并可将其广泛用于筛选酶抑制剂类药物、测定血清酶及免疫分析标记酶、监测特殊毒害性酶抑制剂等[2]。

4-硝基萘酚、4-硝基苯酚等化合物因在410 nm左右有较强的紫外吸收经常被选择作为显色团。本文初步选择4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷作为β-半乳糖苷酶的显色底物，该底物用于β-半乳糖苷酶活性测定等有着广泛的应用前景，因而4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷的合成也具有重要的意义[3]。

糖苷类化合物中含有较多羟基和缩醛结构，一般合成过程都较为复杂，且产物中存在α 与β 异构体，而如何高效地得到单一构型的产物一直是糖苷合成中的重点，现常用的糖苷合成方法如磷酸酯糖供体法、三氯乙酰亚胺酯法等操作过程较复杂，对实验设备要求高且得到的产物选择性不高。本文路线设计先将所有羟基酰化保护即以D-半乳糖为起始原料与乙酸钠反应，通过高温回流乙酰化得到高度选择性β-D-半乳糖五乙酸酯。β-D-半乳糖五乙酸酯经过溴化氢溴代、4-硝基-1-萘酚取代、甲醇钠去乙酰化最后重结晶得到目标化合物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷，合成路线见图1，与常用的方法相比，本研究的合成方法反应条件温和，操作简便可行且产物选择性高，是具有应用价值潜力的合成方法路线。因此该研究为β-半乳糖苷酶-底物水解反应测定酶活性及之后的应用奠定了重要基础。

图1 4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷的合成路线

1 仪器与试剂

1.1 仪器

BS210S 型电子天平（德国赛多利斯公司）；恒奥德HWC-RDY-1B 熔点仪（北京恒奥德仪器仪表有限公司）；Bruker-AV-500 型核磁共振仪（瑞士Bruker 公司）；MicrOTOF QII 高分辨质谱（德国Bruker 公司）；旋转蒸发器RE-52（上海青浦泸西仪器厂）；85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）；电热恒温水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水真空泵（河南巩义市英峪予华仪器厂）；超纯水生成仪（美国Elix MILLIPOER）。

1.2 试剂

4-硝基-1-萘酚（Alfa Aesar，纯度≥98%，批号：10218521）；D-半乳糖、N-溴代琥珀酰亚胺（上海晶纯实业有限公司，纯度≥98%）；液溴、磷（国药集团化学试剂，化学纯）；无水乙酸钠、乙酸酐、乙醇、二氯甲烷、碳酸氢钠、无水硫酸钠、无水碳酸钾、甲醇钠（重庆川东化工基团有限公司，分析纯）；溴化氢溶液、乙醚、石油醚、丙酮、甲醇（成都市科龙化工试剂厂，分析纯）。

2 方法与结果

2.1 β-D-半乳糖五乙酸酯的合成

将5.0 g（27.8 mmol）D-半乳糖，4.6 g（55.6 mmol）无水乙酸钠放入100 ml 单口烧瓶。室温下加24 ml乙酸酐并搅拌溶解，加热至130℃回流3 h。另取一烧瓶加入200 ml 蒸馏水冷却至10℃后将反应液缓慢倒入，冰浴下搅拌2 h，静置待反应液分层后分离上下层，弃去上清液，下层褐色液体加100 ml 水搅拌1 h，褐色固体逐渐析出。减压抽滤，并用少量水洗，用乙醇重结晶，得白色固体7.8 g。经测定熔点145℃，为产物β-D-半乳糖五乙酸酯[4]。

2.2 溴代半乳糖四乙酸酯的合成

取“2.1”项下所得的β-D-半乳糖五乙酸酯2 g（5.1 mmol）溶于7 ml 乙酸置于100 ml 单口烧瓶中并搅拌溶解，冰浴条件下待烧瓶内温约10℃时将33%溴化氢的乙酸溶液2 ml 缓慢滴加，反应2 h。向烧瓶内加入二氯甲烷50 ml，用饱和碳酸氢钠溶液洗至中性，在用水洗2 次，有机层无水硫酸钠干燥1 h 后抽滤，滤液减压蒸馏得到褐色固体，该产物用乙醚-石油醚（1∶2）重结晶，得白色固体1.2 g。熔点80℃，为产物溴代半乳糖四乙酸酯[5-6]。

2.3 4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖四乙酸酯的合成

取“2.2”项下所得的溴代半乳糖四乙酸酯0.23 g（0.56 mmol）加入50 ml 单口烧瓶中，之后依次加入4-硝基-1-萘酚0.11 g（0.58 mmol）无水碳酸钾0.08 g，丙酮5 ml，搅拌下58℃回流5 h，反应完后冷却至室温，减压蒸馏，剩余残渣用二氯甲烷溶解，少量饱和碳酸氢钠溶液洗有机相，有机层无水硫酸钠干燥1 h 后抽滤，滤液减压蒸馏，得褐色油状物0.17 g，为产物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖四乙酸酯[7-8]。

2.4 4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷的合成

取“2.3”项下所得的4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖四乙酸酯0.56 g（1.08 mmol）溶于3 ml 甲醇，加入催化量（200 μl）的1 mol/L 的甲醇钠的甲醇溶液，室温搅拌30 min，静置反应液于0～5℃约8 h，固体析出，抽滤得到滤饼用甲醇/水（3:1）重结晶，得黄色固体0.19 g，为终产物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷[9-10]。

2.5 结构表征

采用核磁共振（1H-NMR、13C-NMR）和高分辨质谱（ESI-HRMS）对终产物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷进行结构表征。

核磁共振1H-NMR（Brucker Avance 500 MHz）数据见下图2、表1。

图2 4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷核磁共振（1H-NMR）结构表征

表1 4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷核磁共振（1H-NMR）解析数据

根据C1 位置氢和C2 位置氢的耦合常数判断绝对构型是糖苷构型确认的常用方法[11]。β 构型的半乳糖苷其C1 位氢和C2 位氢之间的角接近180°，J1,2耦合常数较大，常在7～8。而α 构型其二面角接近60°，J12 耦合常数常在2～4。本研究合成的半乳糖苷核磁共振（1H-NMR）C1 位氢（e）和C2 位氢（d）之间的J1,2 为7.5，说明该化合物为β 构型。

核磁共振13C-NMR（DMSO，BruckerAvance500MHz）数据见下图3、表2。

图3 4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷核磁共振（13C-NMR）结构表征

表2 4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷（13C-NMR）解析数据

高分辨质谱结果显示，4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷计算质荷比[M+Na]+为374.0846，实测结果为374.0848。测定结果支持该终产物即为化合物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷。

2.6 反应条件的优化与关键试剂的选择

因为糖苷产物存在α 与β 两个异构体，而乙酰化反应条件较难控制，溴代反应产物不稳定。为了得到单一的β 构型终产物，故对乙酰化和溴代的反应条件进行了优化。

2.6.1 乙酰化反应条件的选择 D-半乳糖的乙酰化会因反应温度影响而产生不同构型的异构体，α-D-半乳糖五乙酸酯熔点90～95℃与β-D-半乳糖五乙酸酯熔点140～145℃差异较大。而原料D-半乳糖的熔点为165～168℃，两种异构体产物熔点均低于原料D-半乳糖。若反应生成了α 异构体，则产物会在90℃左右开始熔融，若反应全生成了β 构型异构体则产物会在140℃开始熔融。故原料是否反应完全即产物中是否存在原料不影响是否生成α 异构体的判断。据此以产物熔点测定观察其熔融时的温度以确定其中是否存在α 异构体。现固定D-半乳糖和乙酸钠的投料比，以不同的反应温度和时间为影响因素，以D-半乳糖的消耗和是否产生α 构型产物为监测指标，用薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC），以展开剂丙酮/石油醚（3∶10）监控反应中原料D-半乳糖是否反应完全，以熔点仪测定产物初始熔融温度判断是否产生了α 异构体。对乙酰化反应条件进行优化（表3）。

表3 酰化反应结果

在温度低于100℃时不论是延长反应时间还是增加反应温度，原料D-半乳糖均无法完全反应且产物中始终存在α 构型产物，当温度为100℃时，反应1 h仍存在原料，将反应时间延长至3 h 后监控反应原料消失反应完全，但后处理之后用产物测定熔点后发现存在α 构型异构体。后将反应温度增加至130℃回流后反应1 hTLC 监控仍然存在原料，延长反应时间至3 hTLC 监控反应完全，再将后处理得到的产物测定熔点发现其在141℃才开始熔融，说明没有产生α 异构体。综合考虑后，将反应条件设定为回流温度130℃，反应时间为3 h，即为上文“2.1”项中的反应条件。

2.6.2 溴代试剂的选择 在乙酰卤代糖中卤原子具有良好的离去性，使糖基有足够活性可与醇羟基或酚羟基发生取代反应。也因此卤代糖的稳定性较低。而在氟与氯溴相比，以氟代糖的离去性最低，稳定性最好。在和4-硝基-1-萘酚的取代反应中，因与酚羟基发生反应故应选择活性较高的卤代糖，本文选择了活性与稳定性均较好的溴代糖基作为中间体。选择较常用的三种溴代方法对β-D-半乳糖五乙酸酯进行溴代反应实验，反应条件参数见表4，实验具体操作参考文献[8,12-14]，根据实验可操作性、经济性和收率综合考虑选择了最适合的溴代方法，收率=B/A×100%。

表4 不同溴代法反应条件参数及收率

三种溴代方法中，液溴-磷溴化收率最高，但液溴有较强的毒性与腐蚀性会挥发出有强烈刺激性的烟雾，刺激眼睛和呼吸道的黏膜，对实验保护要求很高，且该方法产生杂质较多，分离难度大。N-溴代琥珀酰亚胺溴代收率较低，且原料N-溴代琥珀酰亚胺价格较高。溴化氢的乙酸溶液作溴代法反应条件温和且收率较高。综合考虑成本与实验可操作性选择溴化氢的乙酸溶液作为溴代试剂。

3 讨论

本研究以D-半乳糖为原料，与乙酸钠反应，酯化后得到β-D-半乳糖五乙酸酯。β-D-半乳糖五乙酸酯经过溴化氢溴代、4-硝基-1-萘酚取代、最终水解除去乙酰基，再重结晶得到目标化合物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷。经核磁共振（1H-NMR、13C-NMR）和高分辨质谱（ESI-HRMS）确定了最终产物的结构。为了得到单一β 构型的产物，对关键节点乙酰化反应条件进行了优化。从实验结果可推断出反应温度是产生不同构型产物的最关键因素，并根据原料与两个不同构型产物的熔点差异定性监控是否产生α 异构体，与现今常用的高效液相色谱监控异构体方法相比更加简单易行。考虑到溴代糖的稳定性较低，在对最常用的三种方法进行筛选时除考虑原材料成本、收率和产生的杂质之外，还需要考虑到后处理过程对产物的影响。而用溴化氢乙酸溶液进行溴代反应不仅成本低条件温和，而且后处理简单便捷，更加适合糖类化合物的溴代。

酶联免疫吸附测定是利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法，是目前最常用、最经典的免疫学测定方法。而碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶是酶联免疫吸附测定中最常用的酶。本文中合成的4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷是β-半乳糖苷酶的底物。在该底物的应用研究中，当PH 在5.5～7.6 时4-硝基-1-萘酚在450 nm 的吸收是对硝基苯酚的2.1 倍，是邻硝基苯酚的9.6 倍[15]。而作为显色底物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷在弱酸性或者中性条件下对应的水解酶活性高于现酶联免疫吸附测定常用的显色底物[16-17]。这使得本研究合成的显色底物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷有着较广阔的应用前景和推广价值。

综上所述，本研究成功合成了β-半乳糖苷酶的显色底物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷。反应条件温和，操作简单，原料廉价易得。为β-半乳糖苷酶-底物水解反应测定酶活性及之后的应用奠定了重要基础。