消肿喷剂主药对体外炎症模型小鼠白细胞介素及NLRP3相关蛋白表达影响的研究

杨 涛，李佳思凡，靳圆圆，王水泉，牛淑亮

(新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐830011)

急性骨骼肌损伤是由于患者“经脉不通，血气不行”，导致的 “气滞血瘀”。消肿喷剂是以苏木、栀子等为基础方，采用现代工艺制成的中药喷剂[1]，具有较好的活血化瘀止痛和抑制急性骨骼肌损伤组织炎性因子表达等作用[2]。为进一步明确消肿喷剂促进急性骨骼肌损伤炎症修复的作用机制，研究炎症在急性骨骼肌损伤修复过程中的作用机制，我们用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导C2C12小鼠成肌细胞，造成体外细胞炎性模型，研究NO抑制剂(L-NAME)、NO供体(SNP)和消肿喷剂主药对该体外炎症模型炎症因子IL-1β、IL-18及NLRP3相关蛋白表达的影响，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 C2C12小鼠成肌细胞来源于丰晖生物，细胞培养条件为DMEM(高糖)培养基+10%胎牛血清(FBS)+1%双抗(PS)，37 ℃，5% CO2，饱和湿度。实验细胞经复苏、传代后，冻存备用。

1.2 消肿喷剂主药含药血清制备 参照文献方法[3]，将苏木、栀子、姜黄、乳香、没药按照5∶5∶3∶2∶2比例混合，制备消肿喷剂主药含药血清，备用。

1.3 主要实验仪器 酶标仪(美国Bio-Rad公司，型号iMark)，PCR仪(美国Bio-Rad公司，型号MyCycler Thermal Cycler)，蛋白转膜仪(美国Bio-Rad公司，型号Mini-PROTEAN Tetra system)，电泳仪(北京六一公司，型号DYCZ-24DN)。

1.4 主要试剂 CCK-8细胞增殖/毒性检测试剂盒购自全式金生物公司；LPS购自SIGMA公司；L-NAME购自美仑生物公司；SNP购自Sigma公司；Mouse IL-18 ELISA Kit试剂盒购自联科生物公司；Mouse IL-1β ELISA Kit试剂盒购自联科生物公司；Anti-ASC antibody购自博奥森公司；Anti-NALP3/CIAS1 antibody购自博奥森公司；Anti-Caspase-1 P10 antibody购自博奥森公司。

1.5 炎症模型评估 参照文献方法[4-5]，LPS干预C2C12细胞，进行体外炎症模型造模。取生长状态良好汇合率达90%的C2C12细胞，用完全培养基制备成5×104个/ml单细胞悬液，接种至96孔板中(100 μl/孔，即5×103个/孔)。细胞培养24 h贴壁后，分为空白组和LPS干预组两组，每组5个重复；干预完成后，弃去孔中培养基，每孔加入100 μl配置好的10% CCK-8溶液，置于培养箱中37 ℃孵育，1 h后酶标仪450 nm波长检测OD值，并收集细胞上清，进行IL-1β、IL-18检测。

1.6 炎症模型实验分组及干预方法 分为空白对照组、LPS干预组、NO抑制组、NO激动组和消肿喷剂主药含药血清组(含药血清组)五组。

空白对照组正常培养6 h；LPS干预组：LPS(100 ng/ml)干预6 h；NO抑制组：LPS(100 ng/ml)+L-NAME(2.7 μg/ml)干预6 h；NO激动组：LPS(100 ng/ml)+SNP(8.94 μg/ml)干预6 h；含药血清组：LPS(100 ng/ml)+含药血清干预6 h。

1.7 ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-18蛋白表达 按炎症模型实验分组及干预后模式，收集细胞培养上清，进行IL-1β、IL-18检测。

1.8 qRT-PCR检测ASC、NLRP3、Caspase-1基因表达情况 按照实验分组及干预模式，弃去每组细胞瓶中的培养基，加入1 ml Trizol消化细胞，使Trizol平铺在细胞层面上，反复摇晃细胞培养瓶，直至细胞消化下来，装入1.5 ml EP管中。后续实验按照qRT-PCR试剂盒说明操作。

1.9 Western blot检测ASC、NLRP3、Caspase-1蛋白的表达情况 按照实验分组及干预模式，弃去每组细胞瓶中的培养基，加入3 ml无菌的PBS缓冲液反复冲洗2遍，弃去PBS缓冲液，用胰酶消化细胞。离心后弃去上清留细胞沉淀，用5 ml无菌PBS洗1遍后收集细胞。后续按照Western blot试剂盒说明操作。

1.10 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 炎症模型评估 LPS干预后，C2C12细胞增殖及细胞上清IL-1β、IL-18表达情况，见表1。LPS干预组与空白对照组OD值比较，差异有统计学意义(P<0.01)；细胞上清IL-1β比较，差异有统计学意义(P<0.01)；IL-18表达比较，差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 LPS对各组C2C12细胞增殖及IL-1β、IL-18的影响

2.2 LPS、L-NAME、SNP和消肿喷剂主药含药血清对C2C12细胞上清中IL-1β、IL-18含量的影响 见表2。按照实验分组，分别应用LPS、LPS+L-NAME、LPS+SNP和消肿喷剂主药含药血清干预后，ELISA检测各组C2C12细胞上清中IL-1β、IL-18含量结果。

表2 各组C2C12细胞上清中IL-1β、IL-18含量比较(pg/ml)

IL-1β含量比较，空白对照组与各干预组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；LPS干预组与各组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；NO激动组与含药血清组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

IL-18含量比较，空白对照组与各干预组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；LPS干预组与NO激动组、含药血清组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，与NO抑制组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；NO激动组与含药血清组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 LPS、L-NAME、SNP和消肿喷剂主药含药血清对C2C12细胞中ASC、Caspase-1、NLRP3 基因表达和蛋白表达水平的影响 按照实验分组，分别应用LPS、LPS+L-NAME、LPS+SNP和消肿喷剂主药含药血清干预后，qRT-PCR检测小鼠骨骼肌成肌细胞ASC、Caspase-1和NLRP3 mRNA表达水平，见表3。Western blot检测结果各组小鼠骨骼肌成肌细胞ASC、Caspase-1和NLRP3 蛋白水平，见表4。

表3 各组C2CL2细胞中ASC、Caspase-1、NLRP3 mRNA表达水平比较

表4 各组C2CL2细胞中ASC、Caspase-1、NLRP3蛋白水平比较

ASC mRNA表达水平，空白对照组与LPS干预组、NO抑制组、NO激动组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，与含药血清组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；LPS干预组与NO抑制组、NO激动组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，与含药血清组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；NO激动组与含药血清组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

Caspase-1及NLRP3 mRNA表达水平，空白对照组与各干预组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；LPS干预组与各组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

ASC 蛋白水平，空白对照组与LPS干预组、NO抑制组、NO激动组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，与含药血清组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；LPS干预组与NO抑制组、NO激动组、含药血清组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；NO激动组与含药血清组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

空白对照组与各干预组Caspase-1、NLRP3蛋白水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；LPS干预组与各组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

外因可致经筋受损，气机不畅，筋肉失于濡养，“凝血蕴里不散”，发为红肿热痛。中医的“筋”实指解剖学肌肉[6]，因此急性骨骼肌损伤是由于“经脉不通，血气不行”，导致的 “气滞血瘀”。

消肿喷剂主药苏木、栀子、姜黄、乳香、没药等具有较强的活血、祛瘀、行气功效[1]。NO是由L-精氨酸合成的信号分子[7-9],NLRP3炎症小体是由ASC、Caspase-1、NLRP3组成的多蛋白复合体，炎症刺激能够诱导NLRP3炎性小体发生寡聚化，同时募集相关反应蛋白[10-12]。

现代研究发现，消肿喷剂主药苏木乙醇提取物caesppanin A和tectorigenin，能够显著抑制LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞释放NO,发挥抗炎作用[13];栀子主要有效成分藏红花素能够抑制类风湿性关节炎大鼠模型中一氧化氮合酶(iNOS)的产生和血清TNF-α、IL-1β和 IL-6表达[14],栀子苷通过NLRP3/ASC/Caspase-1途径，抑制系统性红斑狼疮小鼠模型，炎症细胞浸润、IL-1β、IL-18等炎症因子产生[15]；姜黄素能够通过调控SIRT1激活途径[16]和线粒体介导的内源性途径[17]影响炎症反应；乳香、没药能够通过抑制 NF-κB和MAPK 信号通路[18-20]的活性等抑制炎性介质的释放。

为了进一步研究消肿喷剂促进急性骨骼肌损伤炎症修复的作用机制及NO在急性骨骼肌损伤修复过程中的作用机制，我们进行了消肿喷剂主药对体外炎症模型IL-1β、IL-18及NLRP3相关蛋白表达影响的实验研究。

实验中我们应用LPS干预C2C12细胞，成功复制了体外炎症模型。分别应用NO抑制剂L-NAME、NO激动剂SNP以及消肿喷剂主药含药血清对造模细胞进行干预。发现LPS干预C2C12细胞，造成体外炎症模型，IL-1β、IL-18表达明显。应用NO抑制剂L-NAME，抑制NO表达，IL-1β、IL-18表达明显提高，而应用NO活化剂SNP，进一步活化NO表达，IL-1β、IL-18表达明显降低，应用消肿喷剂主药含药血清干预C2C12细胞外炎症模型，能够显著降低IL-1β、IL-18表达；qRT-PCR检测小鼠骨骼肌成肌细胞ASC、Caspase-1和NLRP3 mRNA表达水平以及Western blot检测结果小鼠骨骼肌成肌细胞ASC、Caspase-1和NLRP3 蛋白水平发现，LPS诱导C2C12细胞体外炎症模型，应用NO抑制剂L-NAME和NO活化剂SNP，ASC、Caspase-1和NLRP3 mRNA表达水平和蛋白水平均明显提高L-NAME或降低SNP，消肿喷剂主药含药血清有类似SNP作用，能够显著降低ASC、Caspase-1和NLRP3 mRNA和蛋白表达。

基于以上实验我们推断，LPS激活NO-NLRP3-IL炎症轴，诱导建立C2C12细胞体外炎症模型。NO通过NO/ASC/Caspase-1/NLRP3/IL-1β/IL-18轴，调控骨骼肌体外炎症模型炎症因子表达,消肿喷剂可能通过干预NO表达，减轻炎症反应，促进骨骼肌损伤修复。