银杏内酯B对糖尿病大鼠心肌纤维化的抑制作用

高振华，侯书鹏

糖尿病心肌病是糖尿病病人常见的慢性并发症，也是导致糖尿病病人死亡的主要原因之一。心肌纤维化是糖尿病心肌病早期组织病理学改变，且呈进行性加重，是导致心脏功能恶化的重要因素，表现为心室舒张和收缩功能障碍，泵血功能降低，逐渐发展为充血性心力衰竭[1]。因此，抑制心肌纤维化是糖尿病心肌病防治的重要靶点。银杏内酯B(ginkgolide B)是银杏叶的主要活性成分之一，具有拮抗血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)的作用[2]。相关研究显示，银杏内酯B对肝纤维化及高血压所致心肌纤维化具有明显的抑制作用[3-4]，银杏内酯B通过调节转化生长因子-β1(TGF-β1)通路抑制肾小球系膜细胞外基质的分泌[5]。本研究探讨银杏内酯B对糖尿病大鼠心肌纤维化的抑制作用及其机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 50只无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠，6周龄，体重180～220 g，购自河北省实验动物中心[许可证号：SYXK(冀)2018-004]，清洁环境分笼饲养，室温23～25℃，相对湿度50%～60%，明暗照射各12 h，适应饲养7 d后开展实验。

1.2 实验药物与试剂 银杏内酯B(纯度>95%)购自上海诗丹德生物技术有限公司；链尿佐菌素(streptozotocin，STZ)购自美国Sigma公司；天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)试剂盒和苏木精-伊红(HE)、天狼猩红染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7、β-actin抗体和IgG二抗购自北京博奥森生物科技有限公司；2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠(BCA)蛋白定量试剂盒，二氨基联苯胺法(DAB)显色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 实验仪器 OneTouch Ⅱ型血糖仪(美国强生公司)；Vevo2100型小动物超声仪(加拿大Visual Sonics公司)；LX-20型全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特有限公司)；TB718型石蜡包埋机(湖北泰维医疗科技有限公司)；RM2245型石蜡切片机(德国Leica公司)；DYCZ-40D型电泳槽、DYCZ-24DN型电泳槽(北京六一仪器厂)；DS-5M-L1型光学显微镜(日本尼康仪器有限公司)。高糖高脂饲料配制：基础饲料67.5%，蔗糖20%，猪油10%，胆固醇2.5%。

1.4 实验方法

1.4.1 糖尿病大鼠模型制备、分组与给药 将50只大鼠按照随机数字表法分为正常对照组、模型组、银杏内脂B(GB)低剂量组、GB中剂量组和GB高剂量组，每组10只。正常对照组大鼠给予常规饲料喂养。其余各组大鼠参照沈豪等[6]报道方法，采用高糖高脂饲料喂养4周后，以35 mg/kg剂量腹腔注射1%的STZ制备糖尿病大鼠模型。造模成功判断标准：注射STZ后24 h、72 h，空腹血糖≥16.7 mmol/L。给药：正常对照组和模型组每日1次腹腔注射生理盐水5 mL/kg，GB低剂量组、GB中剂量组、GB高剂量组每日1次腹腔注射6 mg/mL、12 mg/mL、24 mg/mL银杏内酯B溶液5 mL/kg，疗程均为12周。

1.4.2 心功能指标测定 末次给药24 h后，3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液实施麻醉后，采用小动物超声系统取左心室长轴切面，测量左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室射血分数(LVEF)，并计算左室短轴缩短率(LVFS)，LVFS(%)=[(LVEDD-LVESD)/LVEDD]×100%，连续测量5个心动周期，取平均值。

1.4.3 血清AST、LDH、CK-MB含量测定 由腹主动脉取血，2 500 r/min离心，离心半径10 cm，5 min后取血清，采用生化分析仪测定AST、LDH、CK-MB含量。

1.4.4 HE染色观察心肌组织病理学改变 脊椎脱臼处死大鼠后开胸取心脏，取部分左心室心肌组织置于4%多聚甲醛溶液固定，经石蜡包埋后行4 μm连续切片，取部分石蜡切片按照试剂盒操作说明行常规HE染色，中性树脂封片后采用显微镜观察心肌组织病理学改变。

1.4.5 天狼猩红染色法观察心肌组织病理学改变 取其余心肌组织石蜡切片，按照试剂盒操作说明行天狼猩红染色，中性树脂封片后采用显微镜观察各组大鼠心肌间质区和血管壁周围纤维化状况。每张切片取5个不重叠的视野，通过Image-Pro Plus 6.0图像分析软件计算胶原容积分数(CVF)，CVF(%)=(胶原面积/视野总面积)×100%。

1.4.6 蛋白免疫印迹法(Western Blotting)检测心肌组织TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表达 每只大鼠取50 g左心室心肌组织，加入1 mL裂解液于冰上研磨匀浆，静置30 min使其充分裂解，取裂解液，4 ℃、12 000 r/min离心，离心半径10 cm，20 min后取上清液，BCA法检测总蛋白浓度，取30 μg蛋白行十二烷基硫酸钠丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、湿法转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，滴加TGF-β1(1∶800稀释)、p-Smad2/3(1∶1 000稀释)、Smad7(1∶1 000稀释)、GAPDH(1∶1 500稀释)抗体4 ℃孵育过夜，洗膜后加IgG(1∶3 000稀释)二抗室温孵育1 h，洗膜后滴加DAB显色，应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件计算条带灰度值，根据条带灰度值以GAPDH为内参计算蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 各组大鼠心功能指标比较 与正常对照组比较，模型组大鼠LVEDD、LVESD升高，LVEF、LVFS降低(P<0.01)；与模型组比较，GB中剂量组、GB高剂量组LVEDD、LVESD降低，LVEF、LVFS升高(P<0.05或P<0.01)；与GB低剂量组比较，GB高剂量组LVEDD、LVESD降低，LVFS明显升高(P<0.05或P<0.01)；GB低剂量组、GB中剂量组、GB高剂量组LVEF比较差异无统计学意义(P>0.05)；GB中剂量组与GB低剂量组、GB高剂量组LVEDD、LVESD、LVFS比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠心功能指标比较(±s)

2.2 各组大鼠血清AST、LDH、CK-MB含量比较 与正常对照组比较，模型组大鼠血清AST、LDH、CK-MB含量升高(P<0.01)；与模型组比较，GB中剂量组、GB高剂量组AST、LDH、CK-MB含量降低(P<0.05或P<0.01)；与GB低剂量组比较，GB高剂量组AST、LDH、CK-MB含量降低(P<0.01)；GB中剂量组与GB低剂量组、GB高剂量组AST、LDH、CK-MB含量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠血清AST、LDH、CK-MB含量比较(±s) 单位：U/L

2.3 银杏内酯B对糖尿病大鼠心肌组织病理学改变的影响 正常对照组大鼠心肌纤维排列有序，心肌细胞结构完整、排列整齐；模型组大鼠可见心肌纤维断裂，排列紊乱，心肌细胞核固缩深染，大量炎性细胞浸润等病理学改变；与模型组比较，GB低剂量组、GB中剂量组、GB高剂量组大鼠心肌组织病理学改变呈剂量依赖性减轻，其中GB高剂量组心肌纤维排列整齐，心肌细胞形态基本正常，可见少量炎性细胞浸润。详见图1。

图1 各组大鼠心肌组织HE染色图(×200)

2.4 银杏内酯B对糖尿病大鼠心肌间质和血管壁周围纤维化的影响 正常对照组大鼠心肌间质和血管壁周围胶原沉积较少，呈细纹状、均匀分布；模型组大鼠心肌间质区和血管壁周围胶原沉积明显增多，胶原条纹增粗、分布不均匀；与模型组比较，GB低剂量组、GB中剂量组、GB高剂量组大鼠心肌间质和血管壁周围胶原沉积呈现剂量依赖性减少。与正常对照组比较，模型组大鼠心肌间质和血管壁周围CVF均升高(P<0.01)；与模型组比较，GB低剂量组、GB中剂量组、GB高剂量组大鼠心肌间质区和血管壁周围CVF均降低(P<0.01)；与GB低剂量组比较，GB中剂量组、GB高剂量组心肌间质和血管壁周围CVF均降低(P<0.01)；与GB中剂量组比较，GB高剂量组心肌间质和血管壁周围CVF均降低(P<0.01)。详见图2、图3、表3。

图2 各组大鼠心肌间质纤维化天狼猩红染色图(×200)

图3 各组大鼠血管壁周围纤维化天狼猩红染色图(×200)

表3 各组大鼠心肌间质和血管壁周围CVF比较(±s) 单位：%

2.5 各组大鼠心肌组织TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表达比较 与正常对照组比较，模型组大鼠心肌组织TGF-β1、p-Smad2/3表达上调，Smad7表达下调(P<0.01)；与模型组比较，GB中剂量组、GB高剂量组TGF-β1、p-Smad2/3表达下调，Smad7表达上调(P<0.01)；与GB低剂量组比较，GB中剂量组、GB高剂量组TGF-β1表达下调，Smad7表达上调(P<0.01)，GB高剂量组p-Smad2/3表达下调(P<0.01)；GB中剂量组与GB低剂量组p-Smad2/3表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与GB中剂量组比较，GB高剂量组TGF-β1、p-Smad2/3表达下调，Smad7表达上调(P<0.01)。详见图4、表4。

图4 各组大鼠心肌组织TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表达条带图(A为正常对照组；B为模型组；C为GB低剂量组；D为GB中剂量组；E为GB高剂量组)

表4 各组大鼠心肌组织TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白相对表达量比较(±s)

3 讨 论

高血糖所致心肌纤维化为糖尿病心肌病的主要病理机制，也是导致心脏功能降低、心脏器质性病变和糖尿病病人死亡的重要因素之一[7-8]。因此，以抑制心肌纤维化为靶点进行治疗对延缓糖尿病心肌病进展至关重要。

糖尿病属中医学“消渴”范畴，病机为气阴两虚，病程持久致阴损及阳、脾肾阳虚、水湿潴留、瘀血浊毒内停[9]。董丽等[10-11]研究显示，益气活血方能降糖调脂，对心功能具有保护作用。银杏是我国独有的一种中生代孑遗植物，银杏果和银杏叶为传统中药品种。其中银杏叶性平、味苦涩，归心、肺经，具有活血化瘀、通络止痛、化浊降脂之功效。银杏叶主要活性成分银杏内酯B属萜类内酯化合物，具有抑制血小板活化、抗氧化、抗炎、抗凋亡等多种生物学活性[12]，近年来其抗纤维化作用逐渐受到关注。本研究结果显示，银杏内酯B治疗12周能改善糖尿病大鼠心脏功能(降低LVEDD、LVESD，提高LVEF、LVFS)，降低血清AST、LDH、CK-MB含量，减轻心肌组织病理学改变及心肌间质和血管壁周围纤维化，且呈一定的剂量依赖性。

组织纤维化过程有多种细胞因子、生长因子等参与调控，其中，在哺乳动物细胞中广泛表达的TGF-β1促进了细胞外基质(extracellular matrix，ECM)表达与沉积，在心肌组织纤维化中发挥着重要的作用[13]。TGF-β1/Smads信号通路在组织纤维化过程中具有重要的调控作用[14]，Smads家族蛋白是TGF-β1的下游靶分子，其中Smad2、Smad3可被TGF-β1诱导磷酸化后结合生成二聚体p-Smad2/3，p-Smad2/3核转位后与相关基因结合促进ECM转录和表达；Smad7与TGF-β1受体结合，发挥抑制纤维化的作用[15]。本研究结果显示，给予银杏内酯B治疗12周，能下调糖尿病大鼠心肌组织TGF-β1、p-Smad2/3表达并上调Smad7表达，且银杏内酯B呈一定的剂量依赖性，提示银杏内酯B对糖尿病大鼠心肌组织TGF-β1/Smads信号通路具有调控作用。

综上所述，银杏内酯B对糖尿病大鼠心脏具有保护作用，可能与调控TGF-β1/Smads信号通路，抑制心肌纤维化有关，可为银杏内酯B作为糖尿病所致心肌纤维化防治候选药物提供实验依据，但其作用机制有待进一步研究明确。