豁痰解毒通络饮通过内质网应激-线粒体凋亡途径干预大鼠颈总动脉球囊损伤后再狭窄的作用机制

田腾辉，邓 悦，Tumurkhuyag Atartsetseg，常立萍，石 锐，于克英，张 淼

近年来，随着生活方式及饮食结构改变，人们罹患心血管疾病的危险因素不断增加，导致冠心病发病率和死亡率逐年升高，已成为严重威胁人类生命健康的主要疾病之一[1]。经皮冠状动脉介入(PCI)为冠心病病人带来福音，是目前防治心血管疾病的重要手段[2]。新一代药物洗脱支架(DES)的应用极大地降低了急性心血管事件死亡率，但晚期支架衰竭是关注的焦点问题。有研究显示，支架内新生动脉粥样硬化是导致晚期血管再狭窄的重要因素[3]，且与血管内膜中内质网应激-凋亡机制密切相关[4-5]。中医药在再狭窄的治疗中发挥着重要作用[6-7]，在心血管疾病领域中具有广阔的研究前景和挖掘潜力。豁痰解毒通络饮是邓悦教授基于“痰瘀伏络”学说研制的中药方剂，多项研究表明豁痰解毒通络饮有确切的临床疗效[8-9]。本研究探讨豁痰解毒通络饮在再狭窄形成过程中的作用机制，为多靶点防治PCI术后再狭窄提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 5周龄无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠，350～400 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK(辽)2015-0001，饲养于长春中医药大学动物实验中心。本研究动物实验经过长春中医药大学伦理委员会审核。

1.2 实验药物及试剂 豁痰解毒通络饮，组方：全瓜蒌20 g，丹参15 g，金银花30 g，当归15 g，甘松15 g等。中药由长春中医药大学附属医院新绿色颗粒药房提供；阿托伐他汀(辉瑞制药有限公司生产，生产批号：S90893，国药准字：H20051408)；兔源一抗购自Cell Signaling公司；引物序列合成于库美生物科技有限公司。

1.3 实验仪器 7500型实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)仪(美国Bio-Rad公司)；M200PRO型酶标仪(瑞士Tecan公司)；RM2135 石蜡切片机(德国Leica公司)；FL1000型电化学发光(ECL)智能成像仪(美国Thermo Fisher公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 将24只雄性SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、球囊损伤模型组(模型组)、中药组和西药组，每组6只。适应性喂养3 d后行颈动脉球囊损伤术[10]。西药组给予阿托伐他汀[1.19 mg/(kg·d)]灌胃，中药组给予豁痰解毒通络方[16.33 g/(kg·d)]灌胃，其余两组予以等体积生理盐水灌胃。连续灌胃4周。

1.4.2 动物模型构建 术前12 h禁食不禁水，腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，颈部备皮后行颈部正中切口，钝性分离至左颈总动脉，颈外动脉用眼科剪45°作一V型切口，插入球囊约3 cm，调整球囊压力3.0～5.2 atm，将球囊旋转抽出至颈总动脉远心端，重复3次操作，结扎颈外动脉近心端，无出血后逐层缝合。Sham组仅结扎颈外动脉。每只大鼠术后腹腔注射青霉素20×104U预防感染。

1.4.3 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色 取颈动脉损伤段浸入4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋后4 μm切片，经HE染色、封片后光镜下观察各组大鼠颈总动脉内膜增生情况。

1.4.4 免疫组化法实验 将石蜡包埋切片经常规脱蜡水化，通过抗原修复、封闭后，加入C/EBP同源蛋白(C/EBP homoiogousprotein，CHOP)抗体4 ℃孵育过夜，二抗37℃避光放置35min，使用二氨基联苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)显色后苏木素复染，并脱水封片。在400倍光镜下观察血管CHOP蛋白阳性表达情况。

1.4.5 蛋白免疫印迹实验 组织液氮研磨后，加入预冷的RIPA裂解液，匀浆后以12 000 r/min离心10 min，取上清液，采用2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠(BCA)试剂盒测定。配制10%的十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，设置恒压为70 V、30 min，后转为140 V、35 min。聚偏氟乙烯(PVDF)膜于5%脱脂奶粉中封闭1.5 h，一抗(1∶2 000)4 ℃孵育过夜，二抗(1∶2 000)孵育2 h，每个步骤间均以磷酸盐缓冲液(PBST)洗脱5次，每次5 min。ECL显色，采用Image J软件计算灰度值。

1.4.6 RT-qPCR 常规Trizol法提取总RNA，并反转录成cDNA进行PCR实验，体系为25 μL。反转录条件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；PCR扩增条件95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。CHOP引物序列：正向引物为CATGAACTGTTGGCATCACC，反向引物为CTACCCTCAGTCCCCTCCTC；Bax引物序列：正向引物为GAGGACGCATCCACCA，反向引物为GCCTTGAGCACCAGTT；GAPDH引物序列：正向引物为TACCCACGGCAAGTTCAA，反向引物为GCCAGTAGACTCCACGACAT。计算待测样本基因CT值，相对基因表达量用2-△△CT表示。

2 结 果

2.1 各组大鼠颈动脉内膜增生情况 Sham组血管形态完整，内皮层形态完整，内皮细胞单层规律排列，中膜由均匀连续的梭形平滑肌细胞构成；与Sham组比较，模型组内膜增厚，管腔狭窄；与模型组比较，中药组及西药组内膜增生情况缓解。详见图1。

图1 各组大鼠颈动脉内膜增生HE染色图(×100)

2.2 各组新生血管内膜CHOP蛋白阳性表达情况 光镜下，血管平滑肌细胞和内皮细胞胞核中阳性CHOP表达呈黄棕色颗粒。与Sham组比较，模型组颈动脉CHOP蛋白表达量增加；与模型组比较，中药组和西药组CHOP蛋白阳性表达减少。详见图2。

图2 各组大鼠颈总动脉新生内膜CHOP蛋白免疫组化图(×400)

2.3 豁痰解毒通络饮对大鼠颈总动脉蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)、CHOP、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响 与Sham组比较，模型组颈动脉PERK、CHOP、Bax蛋白表达水平增加(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达水平减少(P<0.01)；与模型组比较，中药组和西药组PERK、CHOP、Bax蛋白表达均降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05)。详见图3。

与Sham组比较，＊P<0.01；与模型组比较，#P<0.05。图3 各组大鼠颈总动脉PERK、CHOP、Bax、Bcl-2蛋白表达比较(A为各蛋白条带图；B为PERK蛋白表达柱状图；C为CHOP蛋白表达柱状图；D为Bcl-2/Bax蛋白表达柱状图；E为Bcl-2蛋白表达柱状图；F为Bax蛋白表达柱状图。a为Sham组；b为模型组；c为中药组；d为西药组)

2.4 各组大鼠颈总动脉CHOP、Bax mRNA表达比较 与Sham组比较，模型组大鼠颈总动脉CHOP、Bax mRNA表达增加(P<0.01)；与模型组比较，中药组和西药组CHOP、Bax mRNA表达均降低(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠颈总动脉CHOP、Bax mRNA表达比较(±s)

3 讨 论

近年来，PCI在冠心病治疗中发挥着重要作用。在血管动脉粥样硬化基础上，PCI机械损伤和细胞后叠加作用发生病理变化，引起并持续加重术后管腔再狭窄。再狭窄是造成PCI治疗局限的主要因素[11]。目前，再狭窄的研究多从炎症反应、血栓形成、血管平滑肌细胞增殖与凋亡失衡[12]等方面展开，但潜在的机制需进一步深入探讨。

内质网已成为慢性代谢性疾病的研究热点问题。内质网稳态可能受到多种生理及病理因素影响[13]，内质网稳态紊乱时，诱导自我保护机制即内质网应激反应(ERS)发生，其中，未折叠蛋白反应 (unfolded protein response，UPR)是ERS的主要应激途径。当错误折叠或未折叠蛋白在内质网中不断积累时，UPR信号通过3种已知的驻留蛋白感知：肌醇需要蛋白1(IRE1)、PERK和激活转录因子6(ATF6)。这些压力传感器中每一种蛋白激活均诱导一系列的纠正措施缓解内质网应激压力，病理情况下，持续的ERS可诱导1个或多个促凋亡信号通路活化[14]。多项研究表明，ERS可促进新内膜形成，认为是促进动脉粥样硬化形成的相关因素[15-16]，且ERS诱导的细胞凋亡在动脉粥样硬化斑块形成中发挥着重要作用[17]。PERK是ERS的主要转导子，通过磷酸化α亚基的真核起始因子2(eIF2α)暂时降低蛋白质翻译速度，并纠正翻译中干扰。磷酸化后eIF2α可诱导转录激活因子4(ATF4)及CHOP上调，发挥多种纠正功能[18]。尽管3个内质网压力传感器均可诱导CHOP，其中以PERK最强烈[19]。CHOP持续升高可能通过影响细胞内钙代谢和Bcl家族成员触发凋亡机制[20-21]。Bcl-2家族可调节内质网与线粒体之间的串扰，Bax在线粒体膜中被激活并寡聚，从而诱导细胞色素C和其他凋亡原的释放引发凋亡，且抗凋亡成员中Bcl-2转录下调机制已在CHOP转染的大鼠成纤维细胞系和培养的皮质神经元中得到了证实[22-23]。有研究表明，Bcl-2基因缺失增加了晚期动脉粥样硬化病变中巨噬细胞凋亡，与CHOP介导的Bcl-2下调促凋亡机制一致[24]。

中医学无PCI术后再狭窄的病名，将其归属于“胸痹”的范畴。基于整体观和辨证论治指导下的中医药在改善病人临床症状、延缓再狭窄进程及提高生存质量方面显示出独特优势。豁痰解毒通络饮是邓悦教授根据多年临床经验研制出的中药方剂，认为“痰瘀伏络、蕴结成毒”是本病的主要机制。邓悦教授认为，在心血管疾病病程进展中，伏邪(伏痰、伏瘀)病理状态贯彻始终，“伏邪三期”的提出与PCI术后再狭窄的疾病内涵颇为中的，即冠状动脉狭窄性疾病的临床前期多隐匿迁延，是内皮损伤、脂质代谢、炎症等多种生物学改变的慢性积累过程[25]，多伴有痰瘀互结、毒损心络及正气耗伤的病机。络脉阻塞，日久化热酿毒，营气不从，逆于肉理，血败络腐，与西医动脉粥样硬化斑块破溃出血、炎症浸润等一系列病理改变相似；临床期，斑块破裂继发血栓导致冠状动脉完全或近乎闭塞，形成本虚而痰、瘀毒蕴结标实的病机[26-27]，此时虽应用PCI治疗机械性再通血管，然而其内在病机未得到改善，反而加重血管损伤，继发管腔内再狭窄，使疾病进入迁延缓解期[28]，如此反复。因此，抓住“痰瘀伏络、蕴结成毒”的关键病机，以豁痰解毒通络为主要治疗，可拓宽PCI术后再狭窄的治疗思路，提高临床疗效。

本研究结果显示，球囊损伤后28 d，模型组大鼠血管内皮较Sham组增生并伴管腔明显狭窄，提示建模成功。与模型组比较，中药组血管重构情况得到明显改善，提示豁痰解毒通络饮具有抑制损伤血管内皮增生，减轻血管狭窄的作用。分子水平检测结果可见，豁痰解毒通络饮能下调球囊损伤动脉组织PERK、CHOP和Bax表达，上调Bcl-2表达。推测豁痰解毒通络饮可能通过降低血管内皮细胞中持续存在的ERS，从而减轻细胞过度凋亡造成的损伤，以发挥抑制血管内皮增生的作用。Chen等[29]研究显示，蒲黄总黄酮通过抑制PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径降低氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人主动脉血管平滑肌细胞凋亡，从而改善斑块结构和稳定性。 Yang等[30]研究显示，醛脱氢酶2可降低PERK-CHOP表达，并减少Caspase-3活性，可保护平滑肌细胞免受ox-LDL诱导的ERS及ERS诱导的细胞凋亡。Li等[31]研究显示，利拉鲁肽可明显降低糖尿病大鼠主动脉组织CHOP、GRP78蛋白表达及SREBP-1c、FAS mRNA表达，从而减轻糖尿病性动脉粥样硬化发生。

综上所述，CHOP在ERS诱导的凋亡中发挥着重要作用，抑制ERS-凋亡途径的激活对动脉粥样硬化性疾病是有益的。既往研究多在细胞水平验证，同时关于CHOP下游的凋亡信号研究较少。本研究以大鼠颈动脉球囊损伤为模型，对ERS关键信号进行验证，同时分析Bax和Bcl-2这对拮抗因子的变化，所得结论与既往研究基本一致，补充和完善了豁痰解毒通络饮的作用机制。豁痰解毒通络饮具有多成分、多途径、多靶点的特点，今后仍需进一步探讨其作用机制。