白藜芦醇上调GDF-15调控PI3K/Akt/Bcl-2信号通路对急性心肌梗死大鼠的保护作用

颜仁梁， 夏 黎， 周国洪， 沈小钟

(广东食品药品职业学院， 广州 510520)

急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)是指冠状动脉血管发生急性狭窄和闭塞，引起心肌细胞缺血缺氧及坏死。随着饮食结构和快节奏的生活压力，AMI发病率逐年攀升，且年轻人的发病比例越来越高[1]。AMI是由多种信号途径参与调控的复杂病理过程，目前已发现多个经典的心血管疾病相关的风险因子[2]。生长分化因子-15(Growth Differentiation Factor-15，GDF-15)属GDFs家族，是TGF-β(Transforming Growth Factor-β)超家族的一份子[3]。已有研究表明：GDF-15与肿瘤、妊娠、神经元损伤等多种疾病均相关[4-5]；GDF-15能够修复缺血/再灌注损伤后的心肌，且在临床研究中作为多种心源性疾病的诊断和预后指标[1]；GDF-15在脂质代谢调节、内皮细胞凋亡抑制等方面发挥积极作用[6]；GDF-15可激活磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信号通路(PI3K/Akt信号通路)，进而调节线粒体介导的抗凋亡过程，发挥降低心肌细胞的氧化损伤的作用[7-8]。简而言之，GDF-15是心肌缺血再灌注损伤机制中的一个重要的保护性因子。

白藜芦醇(Resveratrol，Res)是一类主要存在于百合科、蓼科和豆科等多种药用植物中的一种多酚类化合物，具有抗心肌缺血、抗氧化、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、抗炎和抗肿瘤等生物活性[9-11]。已有研究[12]表明：白藜芦醇通过激活PI3K/Akt通路来抑制AMI大鼠的心肌细胞线粒体凋亡作用。但白藜芦醇是否能够通过对上游的GDF-15的上调来激活PI3K/Akt通路，从而发挥心肌保护作用，目前尚不明确。本研究旨在考察白藜芦醇通过对GDF-15的上调来激活PI3K/Akt信号通路，从而调控线粒体介导的抗凋亡机制，为白藜芦醇对心肌缺血的保护作用机制阐述提供研究基础。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级SD健康雄性大鼠60只，体质量200±10 g，广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK(粤)2013-0002，实验动物质量合格证号为NO44007200014522。动物饲养于广东省中医药工程技术研究院SPF级动物实验室，设施使用许可证号为SYXK(粤)2010-0059,保持室温22～25 ℃、相对湿度60%～70%,自由进食。动物实验得到广东省中医药工程技术研究院动物委员会批准，所有操作均严格遵循实验动物管理的相关规定。

1.1.2 药物与试剂 氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、RIPA裂解液购自阿拉丁试剂(上海)有限公司，白藜芦醇(质量分数为98%)购自天津市红桥区波兰听生物试剂经营部，普萘洛尔购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，肌酸激酶(CK-MB)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购自南京建成生物公司，总蛋白提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，BCA蛋白定量试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司，GDF-15、PI3K、Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9抗体购自Abcam公司。

1.1.3 实验仪器 小动物呼吸机由浙江医科大学仪器实验厂提供，蛋白电泳系统和酶标仪购自美国伯乐Bio-rad公司，高速冷冻离心机购自美国科俊仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 心肌缺血再灌注(I/R)模型制备 SD大鼠适应性饲养后，吸入异氟烷致大鼠深度麻醉，仰卧位固定。于心前区第3、4肋间横向开胸，肺动脉圆锥与左心耳下约1 mm处采用5-0手术缝合线结扎左冠状动脉前降支，迅速将心脏沿肋间间隙放回胸腔，迅速挤出胸腔内空气，逐层缝合胸壁肌肉、皮肤。40 min后松开结扎线再灌注2 h。

1.2.2 分组与给药 60只SD大鼠随机分成6组，每组10只，分别为假手术组、模型组、阳性药普萘洛尔组、白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇中剂量组和白藜芦醇高剂量组。阳性药普萘洛尔组术前2 h单次灌胃给予 1 mg/kg普萘洛尔；白藜芦醇低、中、高剂量组分别按10、20、30 mg/kg的剂量每天单次灌胃，连续给药7天；假手术组给予与模型组等体积的生理盐水。第7天各组均按“1.2.1”中方法制备I/R大鼠模型，其中假手术组仅进行开胸、缝合处理。

1.2.3 血清酶学指标测定 各组SD大鼠心肌缺血再灌注4 h后，经腹主动脉采血4 mL，以4 500 r/s离心5 min分离血清，-20 ℃保存待测。采用紫外分光光度计，分别按照乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK-MB)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒说明书操作方法检测LDH、CK-MB、SOD活力和MDA含量。

1.2.4 梗死范围考察 取血后迅速摘取大鼠心脏，生理盐水洗净残血，滤纸吸干，称全心质量。心脏组织垂直其长轴水平切片，每片厚12 mm，置入NBT溶液(pH 7.4)中37 ℃孵育15 min，坏死区域(Necrotic Zone，NZ)呈暗蓝色，非坏死区域(None-crotic Zone，NNZ)呈暗红色，将NZ和NNZ分离，滤纸吸干，梗死区域置于电子天平上称质量。计算心肌梗死率(心肌梗死率=(梗死心肌质量/全心质量)×100%)。

1.2.5 大鼠心肌组织中相关蛋白表达 采用蛋白质印迹法(Western blotting):用RIPA裂解液从心肌组织匀浆中提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，转移至PVDF膜上，将PVDF膜浸泡于脱脂牛奶中，室温密封4 h，加入1∶1 000的GDF-15、PI3K、Akt、Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9一抗，4 ℃过夜，加入1∶500的GDF-15、PI3K、Akt、Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9二抗，室温孵育1.5 h，显影。以β-actin作为内参，统计各蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 白藜芦醇对急性心肌梗死大鼠心肌梗死率的影响

由6个实验组的急性心肌缺血大鼠的心脏染色和心肌梗死率(图1)可知：模型组大鼠心脏的梗死率为34.69%，与假手术组相比呈极显著增加(P<0.01)；给予阳性药普萘洛尔1 mg/kg后，急性心肌缺血大鼠的心肌梗死率下降至25.15%，与模型组相比呈显著性差异(P<0.05)；分别给予白藜芦醇低、中、高剂量后，各组心肌梗死率分别为32.36%、30.53%和24.94%，其中与模型组相比，白藜芦醇高剂量组的心肌梗死率呈显著性减少(P<0.05)。

2.2 白藜芦醇对急性心肌梗死大鼠血清酶学指标的影响

由表1可知：与假手术组相比，模型组I/R大鼠血清的CK-MB、LDH活力和MDA含量升高，SOD活力下降，与假手术组比较呈显著性差异(P<0.01)；分别给予1 mg/kg普萘洛尔和各剂量的白藜芦醇后，阳性药普萘洛尔组和白藜芦醇中、高剂量组均不同程度降低CK-MB、LDH活力，抑制MDA生成并提高SOD活力(P<0.05，P<0.01)，且呈良好的剂量依赖关系。

图1 白藜芦醇对大鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死率的影响±s)

表1 白藜芦醇对缺血再灌注大鼠血清中CK-MB、LDH、SOD活力和MDA含量的影响±s)

2.3 白藜芦醇对急性心肌梗死大鼠心肌组织GDF-15和PI3K/Akt相对表达量的影响

由图2可知：(1)Akt在各组间的表达无显著差异。(2)与假手术组相比，模型组GDF-15的相对表达量显著增加(P<0.01)，且PI3K和p-Akt的相对表达量显著降低(P<0.01)；与模型组相比，白藜芦醇中、高剂量组GDF-15的相对表达量显著升高(P<0.05，P<0.01)，白藜芦醇高剂量组的PI3K和p-Akt的相对表达量也显著升高(P<0.05)。

图2 白藜芦醇对缺血再灌注大鼠心肌组织的GDF-15、PI3K和p-Akt相对表达量的影响±s)

2.4 白藜芦醇对急性心肌梗死大鼠心肌组织凋亡相关蛋白相对表达量的影响

由图3可知：与假手术组相比，模型组的Bax、caspase-3和caspase-9的相对表达量显著升高(P<0.05，P<0.01)，Bcl-2的相对表达量显著下降(P<0.01)；与模型组相比，阳性药普萘洛尔组和白藜芦醇高剂量组显著抑制Bax、caspase-3和caspase-9的相对表达量(P<0.05)，而Bcl-2的相对表达量显著升高(P<0.05)；与模型组相比，白藜芦醇高剂量组Bax/Bcl-2的相对表达量比值显著下降(P<0.05)，并呈剂量依赖关系。

3 讨论

心肌梗死是急性心脏损伤最常见的致病原因之一，临床具有发病急、进展快、病死率高和预后差异大等特点[13]。虽然近年来对心肌梗死的治疗方案有较大进展，但是，心肌梗死后血液再灌注导致大量心肌细胞二次损伤的情况仍难以缓解，因此，减少I/R对心肌细胞的二次损伤在临床治疗心肌梗死和提高预后中具有重要意义[14]。白藜芦醇具有多种生化和生理作用，包括抗血小板、抗氧化应激、抗凋亡和抗炎作用，对心肌细胞改善和心脏功能恢复具有良好的保护作用[15]。为了进一步考察白藜芦醇对I/R大鼠心肌的保护作用，本研究采用结扎冠状动脉前降支再灌注的方法构建I/R模型。研究结果显示：结扎左冠状动脉前降支2 h再灌注4 h后，NBT染色结果表明I/R大鼠心肌梗死率显著升高；血清酶学发现I/R大鼠血清的CK-MB、LDH活性和MDA含量显著上升，SOD活性显著下降，提示造模后CK-MB、LDH和MDA大量外流至外周血中，心肌细胞受到损伤，表明I/R模型构建成功。通过给予Res后，与模型组比较，I/R大鼠心肌梗死率显著下降，且CK-MB、LDH活性和MDA含量显著下降，SOD活性显著上升，验证了Res对I/R大鼠的心肌保护作用。

图3 白藜芦醇对缺血再灌注大鼠心肌组织的Bax/Bcl-2和caspase蛋白相对表达量的影响±s)

GDF-15主要通过调节器官生长、分化及组织修复等发挥抗炎、抗细胞凋亡和抑制细胞生长效应[16]。已有研究表明GDF-15具有心血管保护功能：GDF-15在正常的心肌细胞中呈低水平表达，当心肌出现急慢性炎症、心肌缺血缺氧、心肌再灌注损伤等病理情况时，GDF-15会被内源性因子诱导而表达水平明显升高[17];在I/R动物模型实验中，与野生型正常小鼠相比，GDF-15表达缺陷的小鼠的心肌梗死范围扩大，心肌细胞凋亡增加，而给予重组的GDF-15可有效减少心肌细胞凋亡[18]；GDF-15的表达对于改善心肌缺血的预后具有正向作用[19]； PI3K/Akt是调控细胞凋亡的重要通路，可通过调控下游的Bcl-2、Bax、caspase等多种靶蛋白，从而调控细胞凋亡[20]；在心肌细胞缺血或I/R后，PI3K/Akt通路被抑制，而线粒体凋亡可通过PI3K/Akt通路调节，参与I/R后心肌细胞凋亡[21]。越来越多的研究表明：GDF-15可通过激活PI3K/Akt通路来抑制高糖诱导的内皮细胞凋亡，改善内皮细胞功能[22]；GDF-15能通过激活PI3K及下游信号分子抑制心肌细胞凋亡，发挥心肌保护作用[23]；过表达的GDF-15通过激活PI3K/Akt信号通路来抑制细胞凋亡，作为新颖的信号通路在心肌保护中发挥重要的作用[24]。

4 结论

本研究表明，Res可显著提升GDF-15在I/R大鼠心肌细胞的过表达，进一步激活PI3K/Akt通路，抑制Bax/Bcl-2、caspase-9和caspase-3的蛋白表达并促进Bcl-2的蛋白表达，提示Res可能通过过表达GDF-15来促进PI3K和Akt磷酸化，抑制线粒体凋亡途径。