基于多数据库分析HLA-DPB1在肺腺癌中的潜在价值

杨恒 张军 郭强 林称意 罗卫民 原野 程栋梁 罗湘玉 刘华 郭家龙

肺癌导致的死亡占所有肿瘤死亡的18.4%，是世界上最常见的肿瘤相关死亡原因[1-2]。据文献估计，2020年肺癌死亡人数将占美国所有肿瘤死亡人数的首位，约22.38%[3]。肺癌发病早期临床症状不明显，部分确诊时已为晚期，伴有纵隔淋巴结转移甚至远处转移[4]。因此，肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)的早期诊断和有效治疗对于病人获得较好预后就显得尤为重要[5]。近年来，肿瘤免疫和免疫治疗在肿瘤的治疗中受到重视，正逐渐成为癌症治疗的方向[6-7]。人类白细胞肮原-DPB1(HLA-DPB1)抗原常表达于免疫T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞等表面，主要通过识别并结合相关肽分子向活化的CD4+T细胞提供免疫信息，促进其增殖和细胞毒性，从而在免疫系统中发挥重要作用[8-10]。本研究通过多个在线数据库分析HLA-DPB1在LUAD发生发展和免疫浸润作用，为LUAD的诊断、免疫治疗和预后评价提供新型潜在靶点。

对象与方法

1.Oncomine分析：Oncomine数据库(www.oncomine) 是一个基于基因芯片的数据库和整合数据挖掘平台，可直接在线访问Oncomine数据库，能帮助我们了解全基因组表达相关的研究[11]。本研究中Oncomine用于分析LUAD中HLA-DPB1的RNA水平。筛选条件：P<0.0001；倍数变化=1.5；数据类型为mRNA；分析类型:癌组织 vs正常组织。

2.Timer数据库：Timer数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)是一个全面系统分析多种肿瘤免疫浸润的数据库之一[12]。首先在基因模块我们分析了HLA-DPB1在人类部分肿瘤与相对应的肿瘤旁正常组织之间表达的差异性。然后分析HLA-DPB1表达水平与肿瘤浸润细胞免疫基因标志物B淋巴细胞、T淋巴细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、树突状细胞(DC)、T辅助细胞1(Th1))细胞、T辅助细胞2(Th2)细胞、T滤泡辅助细胞(Tfh)细胞、T辅助细胞17(Th17))的相关性。

3.UALCAN分析：UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)是对TCGA基因表达数据进行深层次分析的开放数据库[13]。本研究通过在该数据库分析HLA-DPB1在LUAD和正常样本的表达,与LUAD临床病理学特征(包括肿瘤分期、淋巴结转移等)之间的相关性及潜在的预后价值。

4.GEPIA 数据库 ：在 GEPIA 数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)中[14]，我们分析了HLA-DPB1在LUAD和正常肺组织中的表达谱，并探究其表达水平与肺腺癌病人临床分期和预后之间的关系。在相关性分析模块中验证了Timer数据库中相关性较强的LUAD浸润细胞免疫标志物基因与HLA-DPB1表达水平之间的相关性。

5.Lung cancer explorer、PrognoScan和Kaplan-Meier plotter数据库：本研究通过PrognoScan(http://www.abren.net/PrognoScan/)、Lung cancer explorer(http://lce.biohpc.swmed.edu/)和Kaplan-Meier plotter(http://kmplot.com/analysis/)在线数据库分析HLA-DPB1的表达水平与LUAD病人预后之间的相关性[15-17]。

结果

1.HLA-DPB1在LUAD组织中的表达降低，并且与LUAD病人临床病理学特征和Tp53突变相关:数据库分析显示，HLA-DPB1在乳腺癌、肝癌、胰腺癌、白血病、肾癌、卵巢癌、神经系统肿瘤等癌症中表达上升，而在一部分肿瘤中表达下降，如肺癌、前列腺癌、结直肠癌、膀胱癌、黑色素瘤和骨髓瘤中表达降低(图1A)。

A.Oncomine数据库中HLA-DPB1在肿瘤中的表达；B.Timer数据库中HLA-DPB1在肿瘤中的表达。aP<0.05;bP<0.01;c,P<0.001。

此外，通过Timer数据库进一步分析HLA-DPB1在各种肿瘤中的表达，我们得出与Oncomine数据库相同的结论(图1B)。

在GEPIA数据库中，我们同样发现HLA-DPB1在LUAD组织中的表达下降，且差异有统计学意义。同时，我们还发现HLA-DPB1的表达水平还与LUAD病人的临床分期有关(图2A～B)。我们在 UALCAN 数据库中也发现HLA-DPB1在LUAD组织中低表达，且差异有统计学意义(图2C)。接下来，我们在多数据中心来源的Lung cancer explorer数据库中对HLA-DPB1表达水平进行Meta分析发现HLA-DPB1在LUAD中处于低表达的状态，预示着低表达HLA-DPB1的病人预后不良(P=2.1E-8)。

A.HLA-DPB1在肺腺癌病人组织中表达下降；B.HLA-DPB1表达下降与肺腺癌病人临床分期相关；C.HLA-DPB1在肺腺癌病人组织中表达下降。

另外，我们还发现了HLA-DPB1表达水平与LUAD病人临床病理学特征和Tp53突变相关(表1)。由此可表明HLA-DPB1表达水平与LUAD病人的发生发展相关。

表1 HLA-DPB1表达水平与肺腺癌临床病理学特征相关

2.HLA-DPB1在LUAD病人中的预后价值：通过使用PrognoScan数据库评估HLA-DPB1表达水平对LUAD病人生存率的影响，我们发现HLA-DPB1表达与LUAD病人的预后具有显著相关性(图3)。HARVARD-LC数据集显示HLA-DPB1高表达与LUAD病人具有较好的总生存期( HR=0.64，95%CI=0.42～0.97，COXP=0.036822)(图3A)。此外，MICHIGAN-LC、GSE13213、GSE13213数据集均显示升高HLA-DPB1表达的LUAD病人倾向于具有更好的总生存期( HR=0.56，95%CI=0.32～0.99，COXP=0.047121；HR=0.47，95%CI=0.33～0.69，COXP=0.000087；HR=0.67，95%CI=0.49～0.91，COXP=0.010309)(图3B～D)。

图3 PrognoScan数据库显示更高的HLA-DPB1表达水平意味着更好的预后

另外，我们在GEPIA、Kaplan-Meier Plotter和Lung cancer explorer数据库中进一步分析发现高表达HLA-DPB1的LUAD病人比低表达HLA-DPB1的病人预后更好(GEPIA:P=0.0022;Kaplan-Meier Plotter:P=2.7E-11;Lung cancer explorer:P<0.01)。这些结果表明，HLA-DPB1的表达降低可能是LUAD病人预后不良的危险因素。

3.HLA-DPB1表达水平与LUAD免疫浸润细胞水平相关：结果发现HLA-DPB1表达水平与LUAD免肿瘤纯度(tumor purity)、B 淋巴细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞具有显著相关性(P<0.05)。见图4。

图4 HLA-DPB1表达水平与肺腺癌肿瘤浸润细胞相关

在Timer数据库的Correlation模块中，我们发现HLA-DPB1表达水平与LUAD免疫浸润细胞(CD8+T 细胞、T 细胞、B 细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突细胞等)上的免疫标志物显著相关(表2)。细致的讲，在LUAD中，HLA-DPB1表达水平与CD8A、CD8B、CD3D、CD3E、CD2、CD19、CD79A、CD86、CSF1R、CCL2、CD68、IL10、IRF5、PTGS2、CD163、VSIG4、MS4A4A、CEACAM8、NRP1、TBX21、STAT1、IFNG、STAT6、IL13、IL21、STAT5B、TGFB1、PDCD1、CTLA4和LAG3等免疫标志物显著相关。

表2 HLA-DPB1表达水平与LUAD肿瘤浸润细胞免疫标志物相关性分析

进一步通过GEPIA数据库验证HLA-DPB1表达水平与LUAD免疫浸润细胞之间的相关性(表2)。我们发现，HLA-DPB1表达水平与LUAD浸润 CD8+ T细胞、T细胞、单核细胞等显著相关。具体而言，HLA-DPB1表达水平与LUAD免疫标志物CD8A、CD8B、CD19、CD79A、CCL2、IRF5、PTGS2、CD163、CEACAM8、NRP1、TBX21、STAT1、IFNG、STAT6、IL13、IL21、STAT5B、TGFB1、PDCD1、CTLA4和LAG3等细胞免疫标志物显著相关。GEPIA分析结果与Timer数据库结果相一致(表3)，均表明HLA-DPB1在LUAD免疫浸润细胞中具有重要的调节作用，可能是参加肿瘤免疫逃逸过程中的重要部分。

表3 GEPIA数据库中分析HLA-DPB1表达水平与LUAD免疫浸润标志物水平之间的相关性

讨论

肿瘤免疫治疗的核心是唤醒体内免疫细胞，通过克服肿瘤免疫逃逸的机制来清除过度增殖的癌细胞[18]，包括免疫系统调节器、采用细胞疗法、肿瘤抗原疫苗和免疫检查点抑制剂[19-20]。目前，肿瘤微环境中的非细胞成分，如各种激素、可溶性蛋白、趋化因子、分子和细胞外基质等，已成为癌症发展的研究重点和热点[21]。因此，探索并发现新型生物标志物来预测LUAD病人预后，并提供新的治疗靶点来改善病人预后显得至关重要。

HLA-DPB1是位于人类第6号染色体上的主要组织相容性复合体Ⅱ级(major histocompatibility complex,class Ⅱ,MCH Ⅱ) 相关DPB1区域的免疫浸润细胞之一，该区域具有高度多态性[22]。HLA-DPB1抗原常表达于免疫T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞等表面，主要通过识别并结合相关肽分子向活化的CD4+ T细胞提供免疫信息，促进其增殖和细胞毒性，从而在免疫系统中发挥重要作用。有研究报告证明，HLA-DPB1可以促进免疫力，对血液系统的免疫治疗至关重要[23-24]。与正常乳房样本相比，HLA-DPB1的mRNA表达在乳腺癌组织中也有所增加，尤其是在雌激素受体阴性、基底样变和三阴性乳腺癌状态下的乳腺癌组织中。生存分析显示，升高HLA-DPB1表达水平预示着病人有较好的总生存期、无复发生存期和远处无转移生存期[9]。HLA-DPA1 表达水平下降与小儿肾上腺皮质肿瘤(adult adrenocortical tumors，ACT)患儿的不良预后显著相关。HLA-DPB1低表达水平与ACT病人短5年无终末生存期相关。此外，HLA-DPB1是影响ACT病人预后的独立因素[10]。

本研究利用多个在线数据库分析HLA-DPB1在LUAD中潜在的临床价值。我们发现，HLA-DPB1在LUAD病人肿瘤组织中的表达下降， 并且HLA-DPB1的低表达与LUAD病人的临床病理特征(性别、年龄、吸烟史、肿瘤分期、组织学亚型、淋巴结转移情况以及Tp53突变情况)和生存时间相关，HLA-DPB1表达降低的病人预后较差，差异具有统计学意义。Meta分析进一步证实其结果的可靠性，表明HLA-DPB1有望成为LUAD病人治疗的新靶点和预测预后的新标志。

本研究在Timer和GEPIA数据库中证实，HLA-DPB1表达水平与免疫细胞标志物CD8A、CD8B、CD19、CD79A、CCL2、IRF5、PTGS2、CD163、CEACAM8、NRP1、TBX21、STAT1、IFNG、STAT6、IL13、IL21、STAT5B、TGFB1、PDCD1、CTLA4和LAG3 等表达水平相关。HLA-DPB1与LUAD免疫浸润关系密不可分。本研究缺乏临床LUAD组织标本中HLA-DPB1的表达情况，是研究的不足。本研究结果表明，HLA-DPB1在LUAD组织中的表达下降，升高 HLA-DPB1表达水平有望改善LUAD病人的预后。HLA-DPB1表达水平与LUAD免疫浸润细胞和免疫标志物分子水平显著相关，预示着其在LUAD进展过程中具有重要的生物学作用，且为LUAD病人的治疗提供了一个新的思路。