利用离体叶片相对病斑面积快速鉴定茭白对胡麻叶斑病的抗性

李芳， 张珏锋， 钟海英， 陈建明

(浙江省农业科学院 植物保护与微生物研究所，浙江 杭州 310021)

茭白又称茭瓜、蒿笋、菰首等，为禾本科菰属多年生水生宿根草本植物，受茭白黑粉菌侵染后刺激而形成的可食用肉质茎，品质鲜嫩、营养丰富，经济价值高，是我国重要的水生蔬菜，也是浙江省种植面积最大的水生蔬菜。2015年浙江省茭白种植面积为2.85万hm2，产量为86.7万t，约占全国种植面积的40%，已成为全国种植面积最大的省份[1]。

茭白胡麻叶斑病是茭白生产上的主要病害，在全国茭白产区普遍发生，严重时造成较大产量损失[2]。胡麻叶斑病主要为害叶片，初密生褐色小点，后扩大为褐色纺锤形或椭圆形斑，长如芝麻粒，病斑周围有黄晕，后期中心变为灰白色[3-4]。目前，茭白胡麻叶斑病的防治主要依靠化学农药，由于频繁施用杀菌剂，导致生产上时常出现茭白不孕茭或茭白植株抽穗的现象，严重影响茭白产量[5]。实践证明，推广抗病品种是防治茭白病害最有效的方法之一。通过茭白田间的胡麻叶斑病抗性调查，可有效筛选出抗性品种，此方式可靠性和重复性较好，但试验周期长，受季节限制，环境可控性较差。利用茭白叶片离体培养进行室内胡麻叶斑病抗性鉴定可有效缩短鉴定周期，试验规模小，易重复和大批量操作。单一接种胡麻叶斑病菌可避免多种病菌对植株抗性造成干扰，利用病斑面积计算发病程度更加科学准确。

本研究共收集12个单季茭白新品种(系)，通过茭白叶片的室内离体培养，快速鉴定胡麻叶斑病的抗性特征，结合田间调查，验证室内评价结果，对比不同品种对胡麻叶斑病的抗病性差异，为茭白抗性品种选育提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试茭白品种

在浙江省余姚市河姆渡镇茭白种质资源圃收集12个单季茭白品种(系)(表1)，部分品种已通过审定，如鄂茭1号、金茭1号、大洋茭[6]，其他品种(系)均未审定。

1.2 菌株收集和培养

茭白胡麻叶斑病菌分离自茭白染病叶片，将染病叶片经75%乙醇浸泡冲洗，再由无菌水冲洗后，剪取小块带病叶块置于PDA平板上，28 ℃下培养5 d后，将叶片病斑处长出的菌丝划线培养，将生长出来的单克隆体进行品种鉴定，鉴定正确的病菌用于抗性鉴定。将胡麻叶斑病菌的菌丝块接种至PDA平板中央，于28 ℃下培养3～4 d，至菌丝长满整个培养基表面时备用。

1.3 茭白离体叶片的病菌接种

取不同品种茭白分蘖期完全展开的倒二叶，剪取6 cm左右，先后经75%乙醇和无菌水冲洗后，将叶片背轴面向上平铺在含有Kana抗性的PDA平板表面。在长满病菌菌丝的培养基相同半径处，用表面灭菌的打孔器，取带有菌丝的PDA琼脂块，直径约5 mm，将菌块置于离体叶片中间部位，使带有菌丝的一面紧贴叶片背轴面，每品种重复3个叶片，以不贴菌丝片的叶片为对照。将平板置28 ℃培养5 d后，用数码相机拍摄清晰照片[7-8]。

1.4 茭白离体叶片病斑面积测量及计算

利用Photoshop软件，将拍摄照片的病斑面积换算成像素[9]，将病斑面积与叶片总面积的百分率减去对照组的病斑所占百分率，计算相对病斑面积，以此衡量不同品种胡麻叶斑病菌的抗性。利用DPS生物统计软件对病斑面积比例进行单因子方差分析和Tukey HSD多重比较[10]，分别在P<0.05和P<0.01两水平分析显著性差异。

1.5 茭白田间胡麻叶斑病的抗性调查

调查资源圃中12个单季茭白对胡麻叶斑病的抗性[11-12]。分别观察茭白植株完全展开的倒一、二、三叶片上胡麻叶斑病病斑的数量，每个品种观察茭白20株，进行叶片病情分级。

分级标准。无病斑为0级，1～5个斑点为1级，6～10个斑点为3级，11～15个斑点为5级，16～20个斑点为7级，>21个斑点为9级。统计病情分级数据，计算病情指数，依此衡量不同品种(系)茭白对胡麻叶斑病的抗性。

2 结果与分析

2.1 室内鉴定

为了检测茭白品种对胡麻叶斑病菌的抗性程度，剪取分蘖期完全展开的倒二叶叶片组织，接种含有胡麻叶斑病菌的PDA琼脂块，于28 ℃下恒温培养，5 d后接种部位出现大小不一的病斑，计算病斑面积比例，并进行方差分析。图1显示，收集到的12个单季茭白品种(系)均受到胡麻叶斑病菌的侵染，叶片出现典型的褐色斑块，不同品种会出现不同面积的病斑，依此可衡量不同品种的抗性。

图1 胡麻叶斑病菌侵染叶片的病斑特征

图2显示，收集到的12个单季茭白品种(系)接种胡麻叶斑病菌后，杭州一点红叶片上相对病斑面积最大，极显著大于其他品种，说明对胡麻叶斑病抗性最弱，相对病斑面积比例均值为7.26%。金茭1号、余茭1号B、本地八月茭和大洋茭的相对病斑面积较小，所占面积为3.25%，2.91%，2.64%和2.60%，分别是杭州一点红病斑面积的44.77%，40.08%，36.36%和35.81%，其间无显著性差异(P<0.05)，对胡麻叶斑病表现出较强抗性。

柱间无相同大小写字母者分别表示组间差异极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)。

2.2 田间抗性

对资源圃中的12个单季茭白品种(系)进行胡麻叶斑病病害调查，并通过计算病情指数来衡量不同品种(系)茭白对胡麻叶斑病的抗性水平。

由表1可知，在田间种植时，12个品种(系)的单季茭白发生了不同程度的胡麻叶斑病，根据病情指数的统计结果可知，杭州一点红胡麻叶斑病病情指数高达42.84，发病情况较严重；大洋茭、本地八月茭、余茭1号B和金茭1号的病情指数都相对较低，发病情况较轻。

表1 茭白品种(系)胡麻叶斑病的病情指数

3 小结与讨论

本研究利用完全展开的倒二叶离体培养接种病原菌，接种胡麻叶斑病菌5 d后记录病斑面积，再利用像素换算面积比例的方式计算叶片菌斑的相对面积比例，以此衡量茭白品种对胡麻叶斑病的抵抗力。此方法具有快速简便和易于重复的优势，适用于大规模鉴定茭白种质资源对常见病害胡麻叶斑病的抵抗力，为田间选育抗病品种提供了参考依据。利用病情指数来衡量病害的发生情况，数据统计效果较好，能够较全面地表现出植株的病害情况。利用室内离体叶片病斑面积鉴定抗性，并结合田间抗性调查结果，既验证了利用离体叶片相对病斑面积比例进行抗性鉴定的可行性，又为田间选育高抗品种提供更全面可靠的依据。

根据试验中不同茭白品种对胡麻叶斑病菌的抵抗力分析，胡麻叶斑病在侵染单季茭白时，叶片呈典型的褐色斑块，验证了接种方法的可行性。对田间病害调查发现，胡麻叶斑病在杭州一点红植株上发生情况较严重，而在大洋茭、本地八月茭、余茭1号B和金茭1号上发生较轻，这与实验室内的抗性检测结果一致，与邓建平等[13]报道的金茭1号在田间抗性监测中对胡麻叶斑病表现出较强的抗性相符。

综上，结合室内抗性鉴定和田间抗性调查的结果，在12个单季茭白品种(系)中，本地八月茭、大洋茭、余茭1号B和金茭1号在室内和田间都表现出对胡麻叶斑病较高抗性，杭州一点红抗性最弱，鄂茭1号、余茭3号、余茭1号A、浙农5号、浙农7号、回山茭、JJ11等的抗病性居中，为田间筛选高抗品种提供参考。利用茭白叶片离体培养鉴定胡麻叶斑病的抗性为大规模快速筛选高抗品种提供一种高效的技术手段。