雷公藤内酯醇对三阴性乳腺癌细胞的作用及机制*

王进军， 文 斌， 金 阳， 杨是修， 王 可， 朱 彤， 胡思杏

1武汉市中医医院风湿科，武汉 430010 2恩施土家族苗族自治州中心医院推拿科，恩施 445099 3湖北中医药大学针灸骨伤学院，武汉 430065

乳腺癌是女性最常见的肿瘤之一，在过去的几十年里，发病率持续上升[1]。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是乳腺癌的一个亚型，其典型特征是雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)和人表皮生长因子受体2(human epithelial growth factor receptor 2，HER2)均为阴性，目前缺乏有效的靶向治疗[2]。TNBC可进一步分为基底样亚型1(basal-like 1，BL1)、基底样亚型2(basal-like 2，BL2)、间充质亚型(mesenchymal，M)和管腔雄激素受体亚型(luminal androgen receptor，LAR)[3]。其中LAR亚型高表达雄激素受体(androgen receptor，AR)及其下游靶点[4]。Gerratana等[5]综述了AR的生物学进展，并指出AR可作为TNBC亚型的新兴治疗靶点。雷公藤内酯(triptolide，TP)是从雷公藤中提取的中药单体，具有多种生物学功能[6-7]。研究表明，TP可通过调控细胞凋亡途径来发挥抗癌作用[8-10]。Wu等[11]研究结果显示，TP和AG1024以剂量依赖的方式抑制2种TNBC细胞系的增殖活力。Varghese等[12]研究表明，TP可抑制TNBC细胞增殖，诱导自噬并激活细胞凋亡。但有关TP对AR调控机制的研究鲜有报道，因此，本研究旨在探讨TP对TNBC细胞MDA-MB-468的作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468(中国科学院上海细胞库)，L15培养液(Solarbio公司)，胎牛血清(AusGeneX公司)，CCK-8(Meilune公司)，雷公藤内酯醇(Aladdin公司)，Pifithrin-α(MCE公司)，Matrigel胶(Jichun公司)，Transwell小室(Corning公司)，Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒(HaiGene公司)，Trizol(Ambion公司)，SYBR FAST qPCR Master Mix(KAPA Biosystems公司)，裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒(Solarbio公司)，PVDF转移膜和化学发光试剂(Millipore公司)，兔抗雄激素受体抗体、兔抗p53抗体、兔抗GAPDH和羊抗兔IgG(Bioswamp公司)。

1.2 细胞复苏与培养

将冻存的细胞从液氮罐中取出，于37℃水浴中解冻。将细胞悬液转移至离心管中，400×g离心3 min，弃上清，加入1 mL培养液后转移至培养瓶中。加入4 mL含10%胎牛血清的L15进行培养，置于37℃、100%空气的培养箱内培养。

1.3 CCK-8检测

收集细胞，调整细胞悬液浓度接种于96孔板，每孔3×103个细胞，每孔体积为100 μL，置于37℃、100%空气培养箱中培养过夜，使细胞贴壁。将细胞分为5组，对照组细胞正常进行培养，其他4组为培养液中分别加入浓度为12.5、25、50和100 nmol/L TP，继续培养24、48和72 h。取出细胞培养板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养4 h。酶标仪检测450 nm波长处吸光度值。计算细胞存活率，筛选TP最佳浓度(50 nmol/L)和作用时间(48 h)。

将细胞分为4组：对照组、TP组(50 nmol/L TP作用48 h)、p53抑制剂组(20 μmol/L Pifithrin-α作用48 h)和TP+p53抑制剂组(50 nmol/L TP+20 μmol/L Pifithrin-α作用48 h)进行后续实验。

1.4 Transwell小室检测

接种前将24孔板和Transwell小室在PBS中浸泡5 min，在Transwell小室中铺80 μL Matrigel胶，放置30 min。采用无血清培养液洗涤细胞，调整细胞密度为1×105个/mL接种到Transwell小室内，每个小室0.5 mL细胞悬液；在Transwell小室下层24孔板中加入0.75 mL含10%胎牛血清的培养液，37℃、5% CO2培养箱中培养48 h。取出培养板，弃去培养液，加入1 mL PBS清洗1次，每孔加入1 mL 4%甲醛室温固定20 min。吸去固定液，PBS清洗1次，每孔加入1 mL 0.5%结晶紫溶液染色30 min后PBS清洗3次，晾干。用棉签擦去Transwell小室内未侵袭的细胞，显微镜下观察，计数每个视野中的细胞数。

1.5 流式细胞术检测

收集各组细胞，取1×106个细胞重悬，400×g，4℃离心5 min，弃上清。加入1 mL PBS重悬细胞，400×g离心5 min，弃上清。加入200 μL PBS重悬细胞，加入10 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI，轻轻混匀，4℃避光孵育30 min。加入300 μL PBS，进行流式细胞仪上机检测。

1.6 qRT-PCR检测

收集各组细胞，加1 mL Trizol提取总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系为：10 μL SYBR FAST qPCR Master Mix，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，1 μL cDNA模板，8 μL ddH2O。反应程序为：95℃预变性3 min，95℃变性5 s，56℃退火10 s，72℃延伸25 s，共40个循环。其中GAPDH作为内参进行样品间的校正，使用2-ΔΔCt法进行统计分析。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

1.7 Western blot检测

收集各组细胞约1×106个，加200 μL裂解液4℃，12000×g离心10 min，取上清，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。以每孔20 μg蛋白上样量进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，分别加入兔抗HIF-1α(稀释比1∶1000)、兔抗VEGF(稀释比1∶1000)、兔抗Myc(稀释比1∶1000)、兔抗MMP-2(稀释比1∶1000)、兔抗MMP-9(稀释比1∶1000)和兔抗GAPDH(稀释比1∶1000)，室温孵育1 h。洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温孵育1 h。洗膜后加入化学发光试剂，曝光显影后，读取蛋白条带灰度值。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 筛选TP最佳作用浓度和时间

采用CCK-8检测MDA-MB-468细胞增殖活力，筛选TP最佳作用浓度和时间。结果如图1所示，不同浓度TP分别作用MDA-MB-468细胞24、48和72 h后，随着TP浓度升高及作用时间延长，细胞增殖活力逐渐下降。当TP浓度为50 nmol/L且处理48 h时，细胞存活率为(63.69±1.37)%。因此后续实验均为50 nmol/L TP作用48 h处理MDA-MB-468细胞。

1：对照组；2：12.5 nmol/L TP；3：25 nmol/L TP；4：50 nmol/L TP；5:100 nmol/L TP图1 TP不同作用浓度和时间对MDA-MB-468细胞增殖活力的影响Fig.1 Effects of TP at different concentrations and time lengths on proliferation activity of MDA-MB-468 cells

2.2 TP抑制三阴性乳腺癌细胞增殖

采用CCK-8检测TP对MDA-MB-468细胞增殖的影响。结果如图2所示，与对照组相比，TP组细胞增殖活力显著降低(P<0.05)；与TP组相比，p53抑制剂组细胞增殖活力显著升高(P<0.05)；与p53抑制剂组相比，TP+p53抑制剂组细胞增殖活力显著降低(P<0.05)。

1：对照组；2：TP组；3：p53抑制剂组；4：TP+p53抑制剂组；与对照组比较，*P<0.05；与TP组比较，#P<0.05；与p53抑制剂组比较，△P<0.05图2 TP对MDA-MB-468细胞增殖的影响Fig.2 Effect of TP on proliferation of MDA-MB-468 cells

2.3 TP抑制三阴性乳腺癌细胞侵袭

采用Transwell小室检测TP对MDA-MB-468细胞侵袭的影响。结果如图3所示，与对照组相比，TP组侵袭细胞数显著减少(P<0.05)；与TP组相比，p53抑制剂组侵袭细胞数显著增多(P<0.05)；与p53抑制剂组相比，TP+p53抑制剂组侵袭细胞数显著减少(P<0.05)。

1：对照组；2：TP组；3：p53抑制剂组；4：TP+p53抑制剂组；与对照组比较，*P<0.05；与TP组比较，#P<0.05；与p53抑制剂组比较，△P<0.05图3 TP对MDA-MB-468细胞侵袭的影响(×200)Fig.3 Effect of TP on invasion of MDA-MB-468 cells(×200)

2.4 TP促进三阴性乳腺癌细胞凋亡

采用流式细胞术检测TP对MDA-MB-468细胞凋亡的影响。结果如图4所示，与对照组相比，TP组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与TP组相比，p53抑制剂组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)；与p53抑制剂组相比，TP+p53抑制剂组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。表明TP可显著促进MDA-MB-468细胞凋亡。

1：对照组；2：TP组；3：p53抑制剂组；4：TP+p53抑制剂组；与对照组比较，*P<0.05；与TP组比较，#P<0.05；与p53抑制剂组比较，△P<0.05图4 TP对MDA-MB-468细胞凋亡的影响Fig.4 Effect of TP on apoptosis of MDA-MB-468 cells

2.5 TP对MDA-MB-468细胞中AR和p53表达的影响

采用qRT-PCR和Western blot检测TP对MDA-MB-468细胞中AR和p53表达水平的影响。结果如图5和图6所示，与对照组相比，TP组细胞中AR表达水平显著降低(P<0.05)；p53表达水平显著升高(P<0.05)；与TP组相比，p53抑制剂组细胞中AR表达水平显著升高(P<0.05)，p53表达水平显著降低(P<0.05)；与p53抑制剂组相比，TP+p53抑制剂组细胞中AR表达水平显著降低(P<0.05)，p53表达水平显著升高(P<0.05)。

1：对照组；2：TP组；3：p53抑制剂组；4：TP+p53抑制剂组；与对照组比较，*P<0.05；与TP组比较，#P<0.05；与p53抑制剂组比较，△P<0.05图5 TP对MDA-MB-468细胞中AR和p53 mRNA表达的影响Fig.5 Effects of TP on AR and p53 mRNA expression in MDA-MB-468 cells

1：对照组；2：TP组；3：p53抑制剂组；4：TP+p53抑制剂组；与对照组比较，*P<0.05；与TP组比较，#P<0.05；与p53抑制剂组比较，△P<0.05图6 TP对MDA-MB-468细胞中AR和p53蛋白表达的影响Fig.6 Effects of TP on AR and p53 protein expression in MDA-MB-468 cells

3 讨论

TNBC为乳腺癌的一种亚型，具有高度异质性，侵袭性强，且预后较差[13]。TP是从中药雷公藤中分离出的一种二萜类生物活性化合物，具有有效的抗癌作用，涉及多个分子靶点和信号通路[14-15]。胡清福等[16]研究结果表明，TP可诱导TNBC细胞凋亡，其作用机制可能与抑制细胞中BRCA1的表达及磷酸化水平有关。孙巍等[17]研究结果显示，TP可通过抑制RCC1/PARP1信号通路的传导，阻止顺铂引起的DNA损伤修复，增强TNBC细胞对顺铂的敏感性。有研究显示10%～50%的TNBC患者表达AR[18-21]，且AR可作为治疗TNBC的新兴靶点[5]，目前也有较多研究报道了TP在TNBC治疗中的作用，但有关TP对TNBC细胞中AR的调控机制仍需进一步研究。

本研究将不同浓度TP作用于MDA-MB-468细胞筛选出TP的最佳作用浓度后，CCK-8、Transwell小室实验和流式细胞术检测的结果显示，TP能显著抑制MDA-MB-468细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡。p53是细胞内重要的抑癌基因，在TNBC中失活时可促进转移扩散和复发[22]。姚方辉[23]研究发现，TP可能通过上调p53启动线粒体凋亡途径从而促进TNBC细胞凋亡。本研究结果显示，p53抑制剂处理后，MDA-MB-468细胞增殖活力和侵袭能力显著升高，凋亡率显著降低；而TP和p53抑制剂联合处理后，逆转了p53抑制剂对MDA-MB-468细胞的作用，这表明TP可能通过p53发挥抑制MDA-MB-468细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡的作用。AR是一种类固醇激素受体，是目前TNBC靶向治疗的研究热点。Liu等[24]和Traina等[25]研究结果表明，AR抑制剂药物恩杂鲁胺可抑制TNBC细胞增殖活力，患者临床受益率可达33%。在本研究中，为了探讨TP是否能通过p53调控AR影响MDA-MB-468细胞增殖、侵袭和凋亡，我们也设置了p53抑制剂组以及TP与p53抑制剂联合处理组。本研究结果显示，TP可显著抑制MDA-MB-468细胞中AR的表达；抑制p53表达可上调AR表达水平；当TP与p53抑制剂联合作用时，TP可逆转p53抑制剂对AR的促进作用，表明TP可通过p53调控MDA-MB-468细胞中AR的表达。

综上所述，TP可抑制TNBC细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡，其作用机制可能与上调p53的表达进而下调AR的表达水平有关。为TP治疗TNBC的临床应用提供了理论基础。