急性心肌梗死患者血浆NETs水平与冠状动脉病变严重程度的关系*

段宇清， 黄 辉， 范 傲， 王 忠，2△

石河子大学医学院第一附属医院 1心内二科 2国家卫健委中亚高发病防治重点实验室，石河子 832000

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是一种常见的心血管急症，其发病主要是由于动脉粥样硬化斑块破裂或糜烂形成血栓栓塞罪犯血管所致，其中炎症反应在动脉粥样硬化中发挥了重要的作用，而中性粒细胞作用最为广泛，贯穿心肌梗死发生发展的全过程[1]。中性粒细胞胞外捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)是近年发现的中性粒细胞发挥功能的一种新的形式，它是由中性粒细胞受到刺激活化后释放到胞外的一种网状结构，主要由双链DNA(dsDNA)和瓜氨酸组蛋白组成，此外，还结合有髓过氧化物酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、组织因子等中性粒细胞的颗粒蛋白[2]。研究显示，循环中的NETs相关成分可能通过激活血小板，触发凝血级联反应，从而导致内皮功能障碍和斑块不稳定，以及冠状动脉血栓形成[3-4]。已有研究发现，在严重冠状动脉粥样硬化患者中，血浆NETs相关结构，如dsDNA、核小体和MPO-DNA复合物大量存在[5]。近期有研究发现，NETs的主要成分dsDNA水平与急性ST段抬高型心肌梗死(acute ST-segment elevated myocardial infarction，STEMI)患者心肌梗死的面积大小、心室重塑和院内不良心血管事件相关[6-7]，提示NETs可能参与了AMI的发生发展。但血浆中NETs及其相关结构与AMI患者冠脉病变严重程度的关系并不清楚。本研究旨在探讨AMI患者血浆中NETs水平与冠脉病变严重程度的关系，为AMI患者危险分层提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2020年10月至2021年5月在石河子大学第一附属医院住院的AMI患者及同期健康体检者各95例作为研究对象，血液标本及信息收集均获得患者的知情同意并通过医院伦理委员会批准。AMI组纳入标准：符合Fourth Universal Definition of Myocardial Infarction(2018)[8]的相关诊断标准，并在发病12 h内接受急诊冠状动脉支架植入术开通罪犯血管的患者。排除标准：伴肾功能不全、肝功能不全；伴类风湿性关节炎、溃疡性肠病、系统性红斑狼疮等系统性疾病；既往有瓣膜性心脏病、持续性心房纤颤等心血管疾病；不同意及不配合完成本研究者。对照组为正常健康人群，依据随机原则与AMI组在性别、年龄上进行匹配。AMI组又根据Gensini评分结果分为冠脉轻度狭窄组(≤36分)34例与重度狭窄组(>36分)61例。

1.2 材料与方法

收集临床基线资料及白细胞计数、血小板计数、肌钙蛋白T、D-二聚体、左心室射血分数等临床指标。在冠脉造影前采外周静脉血5 mL置于EDTA抗凝管中，以3000 r/min离心5 min，分离血浆，储存在-80℃冰箱待用。使用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆瓜氨酸组蛋白3(CitH3)水平，采用PicoGreen荧光染料定量分析血浆中dsDNA水平。CitH3 ELISA试剂盒购于美国Cayman Chemical公司，Quant-iTTMPicoGreen®reagent试剂盒购于美国Invitrogen公司。

冠脉病变分析方法采用标准Judkins法行选择性冠脉造影，根据冠脉造影结果运用Gensini评分系统对病变进行量化。Gensini评分系统包括：①病变部位：左冠脉主干5分，左前降支及左回旋支近段2.5分，左前降支中段1.5分，左前降支远段及左回旋支中段、远段1分，右冠脉及后降支1分，第一对角支1分，第二对角支0.5分，其余小分支0.5分；②管腔狭窄程度：1%～为1分，26%～为2分，51%～为4分，76%～为8分，91%～为16分，完全闭塞为32分。根据每处病变积分计算出Gensini评分。冠脉病变血管定义为冠脉造影确认的主要冠状动脉(左前降支、左回旋支、右冠状动脉)且直径狭窄超过50%以上。按照冠脉病变支数分为单支病变组、双支病变组、三支病变组，若冠脉病变累及左主干则属于双支病变组(不管病变有无累及左前降支、左回旋支)。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组患者基本资料比较

AMI组患者血浆CitH3、dsDNA水平均高于对照组(均P<0.05)。年龄、体质量指数、性别及吸烟、饮酒比例，两组间差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

表1 AMI组与对照组的基本资料比较Table 1 Comparison of basic information between AMI group and control group

2.2 AMI组患者Pearson相关性分析

经Pearson相关性分析表明Gensini评分与血浆中CitH3(r=0.590，P<0.01)、dsDNA(r=0.613，P<0.01)水平呈正相关；冠脉病变血管支数与血浆中CitH3(r=0.368，P<0.01)、dsDNA(r=0.257，P=0.012)水平呈正相关。

2.3 冠脉轻度狭窄组与重度狭窄组临床资料比较

冠脉重度狭窄组血浆CitH3、dsDNA、白细胞计数、NT-proBNP、D-二聚体、MHR水平显著高于冠脉轻度狭窄组；其余基线资料在两组间差异均无统计学意义，见表2。

表2 AMI组中冠脉轻度狭窄组与重度狭窄组临床资料比较Table 2 Comparison of clinical data between mild coronary stenosis group and severe coronary stenosis group in the AMI group

2.4 不同病变血管支数患者血浆CitH3、dsDNA水平比较

与单支病变组比较，双支病变组、三支病变组血浆CitH3、dsDNA水平明显升高，差异有统计学意义(均P<0.05)；双支病变与三支病变两组间血浆CitH3、dsDNA水平比较差异无统计学意义(均P>0.05)，见图1。

与单支病变组比较，*P<0.05图1 AMI患者单支病变组、双支病变组和三支病变组CitH3、dsDNA水平的比较Fig.1 Comparison of CitH3 and dsDNA levels in patients with AMI among single-vessel，double-vessel and three-vessel groups

2.5 Logistic分析

将可能影响AMI患者冠脉重度狭窄的变量进行Logistic单因素回归分析，然后将单变量分析中有显著性差异(P<0.05)的变量纳入Logistic多因素回归分析。结果显示，血浆CitH3、dsDNA是冠脉重度狭窄的独立危险因素，见表3。

表3 冠脉重度狭窄的多因素logistic回归分析Table 3 Multivariate logistic regression analysis of severe coronary stenosis

2.6 ROC曲线

将AMI患者血浆CitH3、dsDNA水平和CitH3联合dsDNA作为检验变量，将冠脉重度狭窄作为状态变量，绘制ROC曲线，结果显示，在识别重度冠状动脉狭窄的AMI患者能力方面，CitH3联合dsDNA优于CitH3、dsDNA两个指标，见图2、表4。

图2 预测冠脉重度狭窄ROC曲线Fig.2 ROC curve predicting severe coronary stenosis

表4 dsDNA、CitH3单独及联合预测冠脉重度狭窄的效能Table 4 Prediction efficacy of dsDNA and CitH3 alone or in combination for severe coronary stenosis

3 讨论

动脉粥样硬化是急性心肌梗死的基本病理基础，与AMI患者的冠脉病变严重程度密切相关[9]。现有的证据表明，炎症在整个动脉粥样硬化的发生和发展过程中起着关键作用[10]，活跃的炎症过程可促使白细胞大量汇聚，分泌蛋白酶(基质金属蛋白酶)，使斑块的纤维帽逐渐变薄，易于破裂，最终导致血栓梗阻冠脉血管[11]。AMI是临床常见的心血管急危重症之一，具有起病迅速、症状危重、病情凶险、预后差等特点。因此，尽早对疾病的严重程度做出评估，可为临床诊疗工作提供重要参考。

众所周知，中性粒细胞属于抵御入侵病原体的第一道防线，是非特异性免疫的重要组成部分，通过趋化、吞噬、脱颗粒作用，消除无菌炎症。目前研究表明中性粒细胞参与了动脉粥样硬化血栓的形成[12-13]，并在急性冠状动脉事件中有一定的预测作用[14]。此外，在缺血/再灌注损伤(IRI)的动物模型中也描述了中性粒细胞和NETs[15]。NETs作为近年来发现的中性粒细胞发挥功能的一种新的形式，具有强有力的促炎、促血栓形成、细胞毒作用，并可通过多种途径促进动脉粥样硬化的发展[16]。本研究检测了AMI患者血浆中NETs主要成分CitH3、dsDNA的水平，结果显示AMI组的CitH3、dsDNA水平明显高于健康对照组，重度狭窄组血浆中CitH3、dsDNA水平明显高于轻度狭窄组，且AMI患者血浆中NETs水平与Gensini评分呈正相关，Borissoff等[5]学者也发现血浆中与NETs的相关结构，如dsDNA、核小体和MPO-DNA复合物在严重冠状动脉硬化或极钙化的冠状动脉患者中显著升高，这与本研究的结果一致，提示NETs可能与AMI患者冠脉病变的严重程度相关。本研究发现AMI三支病变组与双支病变组血浆NETs水平高于单支病变组，且血浆中NETs水平与冠脉病变血管支数呈正相关，提示NETs可能不仅参与了AMI罪犯血管病变的形成，还参与了非罪犯血管病变的形成。本研究中三支病变组与双支病变组之间NETs水平无统计学差异，考虑可能是由于NETs在所有冠脉病变血管中均发挥作用，从而导致两组血浆中NETs的总体水平无明显差异，此外本研究样本量较少，有待扩大样本量进一步探讨。

研究发现，在动脉粥样硬化的小鼠模型中，胆固醇晶体可触发中性粒细胞释放NETs，NETs引发巨噬细胞释放细胞因子，进一步激活辅助性T细胞17(TH17)放大动脉粥样硬化斑块中免疫细胞的招募，引起慢性炎症反应[17]。同样，在危险相关分子模式(如氧化低密度脂蛋白)存在的情况下，血浆中胆固醇的积累可能会导致巨噬细胞炎症小体激活，促进动脉中性粒细胞浸润和NETs的释放，从而加速硬化性病变的形成[18]，以上结果提示NETs可能参与了早期动脉粥样硬化的发生及斑块活动中的炎症反应。Silvestre-Roig等[19]研究发现，在动脉粥样硬化斑块部位，活化的血管平滑肌细胞可诱发NETs的形成，导致斑块不稳定性增加，NETs的相关成分组蛋白可引起血管平滑肌细胞的极化，破坏细胞膜结构，具有强烈的细胞毒性作用，进一步加剧斑块的不稳定性。Stakos等[20]研究发现，在STEMI过程中，血小板与斑块破裂部位的中性粒细胞相互作用后，NETs被识别为表达功能性组织因子，并诱导血小板活化和进一步的凝血酶生成，从而增加NETs促进血栓生成的潜能。NETs通过为血小板，红细胞，细胞外囊泡和促凝血分子提供支架来促进血管闭塞，该支架提供了血栓形成的结构基础[16]。Langseth等[21]研究表明，STEMI患者血清中dsDNA、MPO-DNA和CitH3水平与白细胞计数均呈正相关，且血清中dsDNA水平与D-二聚体呈正相关，本研究也发现在重度狭窄组中白细胞计数和D-二聚体水平明显升高，以上结果提示NETs可能参与了动脉粥样硬化过程中的急慢性炎症反应，最终导致不稳定斑块的糜烂和破裂，进而导致血栓的形成和AMI的发生，其有望成为评估AMI患者冠脉病变严重程度的有效指标。

为了进一步明确血浆中NETs与AMI患者冠脉病变严重程度的关系，本研究中将可能影响AMI患者冠脉重度狭窄的变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，血浆CitH3、dsDNA是冠脉重度狭窄的独立危险因素；除此之外，ROC曲线结果也显示，血浆CitH3、dsDNA对AMI冠脉重度狭窄的患者有一定的预测价值，且CitH3联合dsDNA对重度冠脉狭窄的预测能力明显优于CitH3、dsDNA两个指标，其敏感度和特异度分别为88.5%和70.6%，预测效能较高。

综上所述，AMI患者血浆CitH3、dsDNA水平过表达可能提示冠脉重度狭窄，病情较严重，早期可考虑通过检测AMI患者血浆CitH3、dsDNA水平，并结合其他冠脉病变评估指标预测患者冠脉病变程度，为AMI患者危险分层及临床诊疗工作提供重要参考。