赶黄草活性成分槲皮素和没食子酸对CCl4所致小鼠急性肝损伤的保护作用及机制*

中草药是中华民族瑰宝，赶黄草又名水杨柳、水泽兰，学名扯根菜

，为四川沪州古蔺苗族地道药材。具有清热解毒、活血化瘀、退黄化湿之功效。赶黄草具有保肝

、抗菌

、抗肝癌

、抗氧化

、抗病毒

和降血糖

等作用。赶黄草及其相关生物制剂在临床上广泛应用于酒精性脂肪肝、乙型肝炎、肝硬化和肝纤维化等疾病的治疗

。赶黄草主要含有类黄酮、木脂素类、三萜类、有机酸类、苯乙酮类、酯类和挥发油等多种化学成分

,槲皮素和没食子酸分别属于类黄酮和有机酸类，是赶黄草的重要的成分并且相对含量较高

。因此赶黄草成分中有可能是槲皮素和没食子酸发挥着保护肝脏的作用。本研究通过腹腔注射CCl

构建小鼠急性肝损伤模型，从保护肝脏功能、抗炎症和抗氧化损伤等方面去探究槲皮素和没食子酸保护肝脏的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂 槲皮素和没食子酸(购自湖北诺纳科技有限公司)；ELISA试剂盒：谷氨酸氨基转移酶(ALT)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和还原型谷胱甘肽(GSH)(购自卡米诺公司)；兔抗鼠血红素加氧酶(HO-1)抗体(购自Proteintech公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自碧云天生物技术研究所)；苏木素、伊红(购自珠海贝索生物技术有限公司)。

1.2 动物处理 40只SPF级昆明小鼠，雄性，体重(20±2)g(川北医学院实验动物中心)。适应性喂养1周后，随机分为正常组、模型组、槲皮素组(100 mg/kg)、没食子酸组(100 mg/kg)，每组10只。槲皮素组和没食子酸组每天灌胃1次相应药物，正常组和模型组每天灌胃1次等量生理盐水，连续7 d。末次给药后2 h，除正常组外，其他各组小鼠腹腔注射0.2% CCl

植物油溶液(15 ml/kg)，16 h后麻醉处死小鼠取材。

2.水深 池塘养鳖普遍的水深为1～2m。山塘水库的水深一般在5m以上，因此，山塘水库水深的要求不应太苛刻，只是要求浅水区面积要占有一定的比例，需要有一定面积的浅滩，浅滩面积越大越好。

1.3 肝组织及形态学观察

2.5.2 免疫荧光结果 相较于正常组小鼠HO-1表达，模型组、槲皮素组和没食子酸组小鼠肝脏中HO-1表达均明显增多。槲皮素和没食子酸组肝脏中HO-1表达较模型组增多更为明显，见图6。

2.1 小鼠肝脏及其组织染色形态 肉眼观察肝脏：正常组小鼠肝脏色泽红润、质地柔软、触摸光滑有弹性、边缘透亮。模型组肝脏颜色偏暗、表面可见均匀分布的白色结节、触摸质地较硬。槲皮素和没食子酸干预组小鼠较模型组肝脏损伤形态有所恢复，结节大幅减少，颜色质地接近正常。组织形态学观察可见：正常组小鼠肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，细胞和结构清晰，细胞无肿胀、炎性浸润等病理现象；模型组小鼠肝细胞肿胀明显，可见细胞空泡坏死，存在严重的炎性细胞浸润现象，细胞肿胀变性面积占比44%，较正常组增加(

<0.05)；槲皮素和没食子酸组小鼠较模型组肝细胞肿胀、变性恢复，无明显空泡形成，细胞排列规整，炎细胞浸润减少(如图1)，细胞肿胀变性面积占分别为13%和14%，较模型组明显减少(

<0.05)。模型组小鼠肝脏指数相比于正常组显著升高(

<0.05)；没食子酸组小鼠相比于模型组肝脏指数显著降低(

<0.05)。

1.3.2 肝细胞形态观察 用手术刀切割绿豆大小肝组织放入提前标记的组织包埋盒中。10%甲醛溶液固定24 h。做成中性树脂封片保存。在显微镜下对其进行病理学观察。

1.4 血清中TNF-α和ALT水平测定 建模后16 h，腹腔注射3%戊巴比妥麻醉小鼠。用剪刀剪去两侧胡须，行眼球摘取法取血。ELISA检测TNF-α和ALT水平，操作步骤遵照ELISA试剂盒说明书。

1.6 Western blot测定肝组织中HO-1水平 称取小鼠肝脏100 mg，剪碎用预冷PBS洗涤2次，4℃离心机3 000 r/min离心3 min，弃去上层液体。加入500 μl含有PMSF的细胞裂解液，于玻璃匀浆机在冰水浴中研磨充分。4℃离心机10 000 r/min离心5 min，分离上清。于涡旋振荡10 s，冰上放置20 min，期间震荡3～5次。再于4℃离心机12 000 r/min离心10 min，分离上清。BSA法蛋白定量。调整浓度后加入等量Loading buffer蛋白变性后上样，60 V预电泳至蛋白成一条直线，110 V跑分离胶，参考Marker停止跑胶并转膜。转膜后于5%脱脂奶粉37℃恒温摇床封闭1.5 h，一抗孵育过夜，二抗室温2 h，加入ECL显色液后于凝胶成像系统显示。

1.5 肝匀浆中GSH含量测定 ELISA检测肝匀浆中GSH水平，操作步骤遵照ELISA试剂盒说明。

1.7 免疫荧光测定肝组织中HO-1表达 将组织切片通过微波辐射抗原修复法修复。待恢复至室温过后画阻水圈，5% BSA+0.3% Triton-100进行室温封闭1 h，滴加一抗(1∶100)4℃过夜，滴加二抗(1∶400)室温1 h，滴加DAPI(1∶10 000)30 min立即于荧光显微镜下观察。

2.在Rt△ABC中，∠C=90°，a、b、c分别是∠A、∠B、∠C的对边，下列关系式正确的是( ).

2 结果

1.3.1 摘取肝脏并测定肝脏指数 取血后，脊椎脱臼法处死小鼠并迅速开腹取肝。于提前预冷的4℃ PBS溶液冲洗小鼠肝脏，吸水纸擦干后称重并计算肝脏指数。肝脏指数计算公式为：(肝脏重量/小鼠体重)×100%。

2.2 小鼠血清中ALT水平 模型组小鼠相比于正常组小鼠血清中ALT显著升高(

<0.01)，而槲皮素和没食子酸干预小鼠后，其血清中ALT水平较模型组显著降低(

<0.01) ，见图2。

2.3 小鼠血清中TNF-α水平 相较于正常组，模型组小鼠TNF-α显著升高(

<0.01)，这与HE染色所看到的炎性浸润结果相符合，见图3。

2.4 小鼠肝匀浆中GSH水平 相较于正常GSH水平，模型组和没食子酸组小鼠肝匀浆中GSH表达均减少(

<0.01)。相较于模型组GSH水平，槲皮素和没食子酸组肝匀浆中GSH水平显著升高(

<0.01)，见图4。

2.5 HO-1蛋白表达水平

首先，我们利用CCl

这一常用动物肝脏损伤模型构建试剂制备动物模型，其间施以槲皮素及没食子酸单体药物干预。肝脏形态及组织HE染色结果显示：CCl

确导致严重的急性肝损伤，而槲皮素及没食子酸干预后，小鼠无论在肝脏指数、炎症损伤和组织形态学指标等方面均得到了很好的恢复。

很好地处理理论与教学实践之间的关系当然也应被看成教师专业成长的又一重要因素，以下则是这些年的课改实践给予人们的一个重要启示或教训：与片面强调理论的学习与落实相比较，应当更加注重“理论的实践性解读”与“教学实践的理论性反思”．

（3）应采用级配中粗砂作为水泥砂浆的砂料，含泥量≤3%；水泥砂浆比例为1∶1，水灰比大于0.35且小于0.45，砂子粒径≤1.0mm，灌浆液稠度应为灌注朝上垂直孔而不致发生垂流。

3 讨论

赶黄草因其强大保肝功效、低毒性等特点越来越受到研究人员们的关注。但赶黄草成分中具体是哪些活性物质发挥着保护肝脏的作用以及其保护肝脏的机制仍有待进一步研究。杨丽娜

和朱一伦

等人在赶黄草药物成分上的研究表明，槲皮素和没食子酸在赶黄草中含量相对较高，且二者分别属于类黄酮物质和有机酸类。本文以此为基础，研究赶黄草主要活性成分槲皮素和没食子酸对肝损伤的保护作用及其机制。

由表2和图2可以看出，东营市的绿色经济发展水平在2007—2016年总体呈现上升趋势。生活消费系统、环境系统、能源系统保持着较好的上升趋势，具体如图3所示。

2.5.1 Western blot结果 相较于正常组小鼠水平HO-1，模型组、槲皮素组和没食子酸组小鼠肝脏中HO-1表达水平显著升高(

<0.01)。槲皮素和没食子酸组小鼠肝脏中HO-1水平比模型组表达显著升高(

<0.01)。其中槲皮素组HO-1升高更加明显，见图5。

其次，在肝功能方面，ALT反应肝脏损伤严重程度，通过槲皮素及没食子酸干预后，ALT明显下降，说明肝脏损伤趋于恢复，但仍高于正常对照，其主要的原因可能是CCl

作为一种强肝毒性物质其损伤程度较高，因此，难于在实验终止时间内完全恢复正常。

另外，肝脏损伤与机体组织器官抗氧化应激能力密切相关

，因此，我们检测了组织中抗氧化应激过程中的两种主要酶GSH及HO-1。当CCl

大量进入机体后，会侵袭肝脏从而产生过量自由基，导致氧化-抗氧化系统失去平衡，造成严重的肝损伤

，损伤过程中细胞能通过不断消耗GSH来抵抗氧化应激损伤

。我们的实验结果也证实，在应用槲皮素及没食子酸干预后，肝组织中GSH水平明显升高，尤以槲皮素更为明显，因其恢复水平与正常组几乎无差异，说明其确能通过升高GSH水平，从而达到增强小鼠抗氧化应激损伤的能力。

血红素氧合酶(HO)系统主要由HO-1和组成型血红素氧合酶-2(HO-2) 构成。其中HO-1系统是机体抗氧化应激的另一重要机制

。高水平的HO-1能够增强机体对氧化应激损伤的抵抗能力

。正常情况下体内的HO-1表达较低，当机体受到急性应激性刺激时，血红素氧合酶系统会被激活，从而诱导HO-1的上调来增强机体的抗氧化应激损伤能力。本研究中Western Blot和免疫荧光结果显示，槲皮素和没食子酸能够上调小鼠肝脏中HO-1蛋白的表达，从而达到保护肝脏免受氧化应激损伤的目的。

魔刀松开捏了一把汗的手长出了一口气。“常兄轻松了许多。”魔刀听到大幻剑的传音点头道：“我非自贬，一旦出手无论是天问还是我都会倾力而为，可三少既然首肯，该是想借此将天问大师和紫阳道长收之麾下，而不是一场非死即伤的豪赌。”

生命体验以个体生命存在为基础，强调对生活感受和生命意识的重视，是人在观照生死及一系列生存状态时的情感表达和感悟升华。在语文教学过程中注重体悟作者蕴含在作品中的生命体验，能够帮助学生更好地理解生命、感悟生命、尊重生命，使生命意义得到彰显和扩展。当下，由于功利主义的盛行，分数是学生的唯一追求，语文教学大多被当作是以读、写、诵为目的的机械性知识传递活动，这样不仅抹杀了语文学科的人文性，也忽视了学生的生命发展。因此，语文教学应该关注生命体验，通过实施行之有效的策略，让学生在在体悟作者复杂情感体验的基础上获得启发和引导，不断促进学生生命成长。

急性肝损伤属于炎症性病理反应，TNF-α是一种炎症性细胞因子，在炎症反应中多有表达。本研究中ELISA结果显示槲皮素和没食子酸能降低肝损伤小鼠血清中TNF-α的含量，从而保护肝脏免受炎症损伤。然而，在肝损伤中TNF-α既可以参与肝损伤，又能发挥保护作用。当TNF-α超过一定浓度后能够激活肝细胞内的一系列信号通路，从而启动凋亡程序加速肝细胞的死亡，加重肝损伤程度。而在低浓度时又能够快速进入损伤的肝细胞中，抑制肝细胞凋亡，同时促进上皮细胞增殖，促进肝损伤的修复过程。因此，本研究中两干预组TNF-α浓度明显降低可能是通过初期阶段减轻肝脏损伤作用和后期促进肝脏损伤修复作用的共同结果。

综上，赶黄草活性物质槲皮素和没食子酸均具有保护肝脏免受损伤的作用。其作用机制主要通过降低ALT水平保护肝脏；上调GSH和HO-1来增强肝脏的抗氧化应激损伤能力；抑制TNF-α炎症因子进而保护肝脏免受炎症损伤。因此，赶黄草及其主要活性成分确可作为临床肝脏炎症损伤性疾病治疗的主要药物。本研究也为开发设计及合成新型保肝治疗药物奠定了一定的理论基础。

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