不同病因肝硬化患者肠道菌群变化研究*

肝硬化(LC)是由多种原因引起的肝纤维化，严重危害患者身体健康

。研究表明，肠道菌群与多种肝脏疾病密切相关

，肠道菌群可通过肝肠轴对肝脏代谢产生影响。肝脏疾病患者的肠道菌群结构受饮食、营养状况、酒精摄入、胆汁酸代谢受损等影响

。为了解不同病因肝硬化肠道菌群的特点，本研究应用高通量测序方法分析不同病因肝硬化患者及健康受试者的肠道菌群，旨在阐明各组间菌群结构的差异，发现潜在生物标志物以及进一步研究菌群功能，探讨差异菌属及代谢通路与肝硬化病因的相关性，为肝硬化的诊疗提供新的思路。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集2018年3月至2019年1月就诊于山西省中医院符合纳入排除标准的肝硬化患者66例，同时收集健康成年人10例作为健康对照组。肝硬化诊断标准参考中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员修订的《肝硬化中西医结合诊疗共识》

。各原发病分别参考相关指南和标准

。所有病例资料均经过山西省中医院伦理委员会审查通过(省中医伦字：2016-05006)。

1.2 纳入及排除标准 符合上述诊断标准的肝硬化患者；健康对照组纳入健康自愿者，排除急慢性肝胆及其他消化道疾病，常规检查未见异常；自愿参加研究并表示知情同意者。排除标准：妊娠或哺乳期妇女；入院前4周内使用抗生素及微生态制剂者；合并有其他系统性疾病者；有胃肠道感染、溃疡病及肾功能异常者。

1.3 分组及测序方法 将肝硬化按照病因分为乙型肝炎(HBV)组、丙型肝炎(HCV)组、原发性胆汁性胆管炎(PBC)组和酒精性肝病(ALD)组。

所有粪便样品均于排便后迅速收集至密闭粪便储存盒内，保存于-80℃的冰箱内，统一送至上海派森诺公司检测。提取粪便样本总DNA，根据细菌16S rRNA V3-V5区设计引物进行扩增，利用Illumina Miseq平台进行高通量测序；测序结果经过Reads拼接，OTUs聚类，物种注释等，最终得到样品物种信息。

2.2 测序质量评价及多样性分析 采用高通量测序方法，共测出序列3 121 675条，其中肝硬化患者平均46 194条，健康对照组平均63 202条。代表序列 98 908条，平均长度为435.69 bp，表明当前测序深度已足够反映肝硬化患者及健康对照组肠道菌群多样性及丰度。

2 结果

2.4.1 门水平物种分析 门水平分析结果显示，各组均以厚壁菌门(

)、放线菌门(

)、变形菌门(

)、拟杆菌门(

)为主，约占总体的90%。放线菌门在各组间具有显著差异(

<0.05)。HBV组患者肠道放线菌门相对丰度低于健康对照组，拟杆菌门相对丰度高于健康对照组，差异具有统计学意义(

<0.05)，见表3。

在当地政府和公平贸易组织的共同协作下，在当地建立藏绣合作社。一方面，请专业的有经验的绣娘，对传统的、新颖的刺绣技艺进行培训；另一方面，为绣娘提供固定的劳作场所，创造人际往来的空间，吸引更多的绣娘加入合作社，在实现藏绣的量产和质量监控的同时，有效带动当地妇女就业。除此以外，合作社还是一个社区互助组织，可以充分使用公平贸易公益反馈资金在当地社区开展“藏绣传承人计划”、教育反哺和困难帮扶等项目。

13段第2句，句式比较简单,但需要区分两个介词to的用法和含义，to whom he was faithful和to the day of his death，两者的含义不同，前者是prep+关系代词，词组be faithful to忠实于某人某物，后者prep表示直到某个时间为止。

2.3 菌群多样性分析 Alpha多样性指数(Chao1指数、ACE指数、simpson指数及shannon指数)比较，健康对照组均高于肝硬化各组，但差异无统计学意义(

>0.05)，见表2。其中，chao1指数及ACE指数反映菌群丰富度；simpson指数及shannon指数反映菌群多样性。说明肝硬化组各组患者菌群多样性及丰度较健康对照组有所下降，以丙型肝炎和酒精性肝病下降最为显著。

2.4.3 功能分析 对差异菌属进行代谢功能预测，结果显示KEGG二级通路中，与健康对照组相比，HBV组聚糖的生物合成与代谢上调，心血管疾病与循环系统下调，差异具有统计学差异(

<0.05)；与健康对照组相比，HCV组氨基酸代谢上调，免疫系统下调，差异具有统计学差异(

<0.05)；PBC组遗传信息复制与修复通路上调，与健康对照组相比具有统计学差异(

<0.05)，见图2。

2.4.2 属水平差异物种分析 属水平共筛选出18种差异物种，分别为费杆菌属(

)、肠球菌(

)、柯林式菌属(

)、肠杆菌(

)、 乳球菌(

)、乳酸菌(

)、杆菌属(

)、毛螺菌属(

)、棒杆菌科(

)、双歧杆菌(

)、致病杆菌属(

)、亮粘菌(

)、伯克霍尔德氏菌(

)、迷走球菌(

)、嗜果菌(

)、短v属(

)、肠球菌(

)、不动杆菌(

)，见图 1。

2.4.4 优势菌群分析 为了进一步筛选出筛选出各组的优势物种，本研究采用LEfSe对所有分类单元物种进行分析。结果显示，基于属水平的潜在生物标志物主要有6种。健康对照组优势菌属为柯林斯氏菌(

)；HBV组优势菌属为毛螺菌属(

)、杆菌属(

)；HCV组优势菌群为肠球菌(

)、乳球菌(

)；ALD组优势菌属为致病杆菌属(

)；尚未发现PBC组中属水平优势物种，见图3。

2.1 患者基线情况 肝硬化各组年龄性别与健康对照组(HC)相比无统计学意义(

>0.05)，肝硬化各组间年龄性别差异无统计学意义(

>0.05)。见表1。

2.4 差异物种分析

2.3.1 尔雅通识课程选课情况。尔雅通识课程作为公共选修课程的补充，学生按培养方案要求在指定的学期内完成公共选修课程学习，医学专业学生主要在通科培养阶段即基础学习阶段完成公共选修课程学习，为临床通科学习阶段打下坚实的基础。

成功的品牌定位是服务价值被认同的助推剂。品牌定位是一种创造性的思维活动，它不是针对阅读推广服务本身，而是对潜在读者的心理所采取的行动。即将服务定位在读者的心目中，使其在读者心中占据一个有利位置，并与其建立一种内在的联系，这样，当读者的需求一旦产生，首先就会想到这个品牌[2]。

2.5 代谢通路-菌群相关性分析 将优势菌群与差异代谢通路做相关性分析得出，杆菌属和毛螺菌属与心血管疾病呈负相关，与免疫系统呈正相关。肠球菌与免疫系统呈负相关，与循环系统及心血管疾病呈正相关。致病杆菌属与遗传信息复制和修复、免疫系统呈负相关，见图4。

近些年来，玉米种植区玉米粗缩病发病面积一直上升，危害逐年加重，成为玉米生产的主要病害之一。通过近些年对玉米粗缩病发生的影响因素做了分析，了解了玉米粗缩病的发生原因，并找到了防治该病的有效措施。

3 讨论

本研究通过高通量测序获得代表序列有98 908条，平均测序长度为435.69 bp，说明采用该方法适用于肝硬化及健康人群肠道菌群的差异分析。Alpha多样性指数分析结果显示相较于健康对照组，肝硬化患者肠道菌群多样性及丰度有所下降，与文献报道一致

，以丙型肝炎和酒精性肝病下降最为明显。研究表明

，相比其他慢性肝硬化，丙型肝炎导致的肝硬化肠道菌群多样性下降更为明显，这与本研究结果相一致。

从菌群结构上看，各组在门水平均以厚壁菌门、放线菌门、变形菌门和拟杆菌门为主。与健康对照组相比，HBV组放线菌门相对丰度降低，拟杆菌门相对丰度增高。属水平上差异物种共有18种，经优势物种筛选，最终确定6种潜在生物标志物。健康对照组中柯林斯氏菌相对丰度较肝硬化组明显增多。HBV组患者杆菌属和毛螺菌属具有优势。相关研究表明，毛螺菌属可产生短链脂肪酸，具有抗炎作用

。本研究中对于菌群功能的分析发现，杆菌属和毛螺菌属可提高机体免疫，降低心血管疾病风险，从功能上属有益菌，可能对乙型肝炎病毒的清除具有积极作用。HCV组中肠球菌和乳球菌相对丰度增加，为潜在生物标志物，这与以往研究结果相一致

。肠球菌为条件致病菌，过度增多会导致肠道菌群失调，对机体代谢产生影响。ALD组患者中致病杆菌属具有优势，推测致病杆菌属可能与体内乙醇代谢有关。本研究中致病杆菌属可影响机体免疫系统和遗传信息的复制与修复，以往研究表明酒精性肝病与遗传因素相关

，而肠道菌群是否通过遗传因素来影响酒精性肝病的发生发展仍有待进一步探讨。

对于菌群代谢通路的分析发现，与健康对照组相比，肝硬化组与生物系统、代谢、疾病相关代谢通路出现显著差异，表明肝硬化患者出现明显代谢失调，循环系统和免疫系统出现紊乱，从而增加了某些疾病发生的风险。这些研究为肝硬化病机的阐明及相关并发症的预测提供了一定的理论基础。肠道菌群失调可能是肝硬化相关并发症如肝性脑病、自发性细菌性腹膜炎等发生的重要因素

。

综上所述，肝硬化组中显著上调的细菌主要为致病菌，可在肠黏膜屏障受损、机体免疫力降低及菌群失调时对人体产生影响，从而导致或加重疾病的发生发展。不同病因所致肝硬化患者与健康受试者的肠道菌群存在显著差异。肠道菌群失调是导致肝硬化的一个重要原因。相关研究表明调节肠道菌群可降低肝硬化患者血浆内毒素水平，改善肝功能

。本研究通过分析不同病因肝硬化患者肠道菌群的差异性，提出不同病因肝硬化的潜在生物标志物。通过相关性分析揭示了肝硬化病因-菌群-代谢通路的相互关联，阐明了肠道菌群结构及功能的改变在肝硬化的发生发展中发挥了潜在的致病或治疗作用。同时为寻找肝硬化的生物学标志物和预测相关并发症提供了新的思路，以及为后续以肠道菌群或代谢通路为靶点干预肝硬化的发生发展奠定了理论基础。

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