超高效液相色谱串联高分辨质谱对刺梨槲皮素及其糖苷类化合物的鉴定分析

王翼 顾苑婷 丁筑红 陈思奇 肖仕芸 余奕宏 杜勃峰 宋煜婷

摘要为探明刺梨中的槲皮素组分及其结合态糖苷类化合物构成，采用超高效液相色谱串联高分辨质谱法，通過标准品保留时间对照、相对分子质量、二级质谱碎片等信息对刺梨槲皮素及其糖苷类化合物进行了解析。从刺梨中共鉴定出1种槲皮素与9种含有槲皮素母核结构物质，可确定化学组成的化合物为槲皮素、槲皮素3O鼠李糖苷、槲皮素3O葡萄糖苷、槲皮素3O[6"O（3羟基3甲基戊二酰）βD半乳糖苷]、槲皮素3O葡萄糖鼠李糖苷，其中，槲皮素3O鼠李糖苷、槲皮素3O葡萄糖苷、槲皮素3O[6"O（3羟基3甲基戊二酰）βD半乳糖苷]首次在刺梨中发现。根据离子碎片推断槲皮素糖苷裂解途径，丰富了刺梨资源的基础研究成果，为槲皮素结构鉴定以及后续开发刺梨槲皮素糖苷的药食利用价值提供了参考。

关键词刺梨; 槲皮素; 槲皮素糖苷; 超高效液相色谱串联高分辨质谱

1引 言

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）系蔷薇科蔷薇属落叶灌木，原产我国西南部[1]，刺梨中的功能活性成分包括维生素C、超氧化物歧化酶、刺梨黄酮、刺梨多糖，以及多种人体必需氨基酸，黄酮为其主要活性成分。槲皮素及糖苷化合物属于黄酮醇（Flavonol），是典型的黄酮类化合物。槲皮素结构带有多个羟基，易结合糖基形成糖苷，糖基连接的类型与位置不同，所形成的槲皮素糖苷也不同。槲皮素及其糖苷具有抗肿瘤、抗病毒、治疗糖尿病和保护心血管的作用[2]，具有良好的药用价值。

槲皮素苷元及其糖苷分析鉴定的常用方法有薄层扫描法、荧光光度法、示波极谱滴定法、高效毛细管电泳法（HPCE）、高效液相色谱法（HPLC）及液相色谱法质谱联用法（LCMS）等。其中，HPLC检测快速准确、操作简便、重现性好[3]; 质谱技术具有快速、精确、灵敏[4]等优点，可以提供被测物的分子量、分子式与丰富的结构信息[5]，在糖苷类天然产物结构鉴定中发挥了重要作用[6]; 超高效液相色谱串联高分辨质谱法具有高分辨率、精确分子质量、多种扫描和碎裂组合的特点[7]，可同时实现母核、子离子的高分辨采集及质谱碎裂信息获取，除了可鉴定已知化合物，还可以通过不同化合物的裂解规律及特征碎片离子信息推断未知化合物[8]。丁丽娜等[9]采用超高效液相色谱质谱联用技术对沙棘果中的黄酮类化合物进行鉴定，在沙棘果的超临界CO2萃取物中鉴定出18种黄酮类化合物。 张伽妹等[10]利用超高效液相色谱线性离子阱静电轨道场高分辨质谱联用技术对柘木提取物中的化学成分进行分析鉴定，根据高分辨质谱提供的准分子离子和碎片离子的精确质量信息，结合相关文献数据，鉴定出28种黄酮类化合物，并分析了槲皮素、染料木素、环桂木黄素、槲皮素7葡萄糖苷等物质的裂解规律。刺梨果实中已经被报道的黄酮苷及苷元有槲皮素、山奈酚[11]、杨梅素[7]、槲皮3O葡萄糖鼠李糖苷、儿茶素、表儿茶素、原花青素B1、没食子儿茶素（4α>8）儿茶素、山奈酚3OβD（6''（E）p酰基）吡喃葡萄糖苷[12]。目前，对刺梨槲皮素及糖苷的报道仅限于槲皮3O葡萄糖鼠李糖苷及槲皮素的提取方法与含量测定研究[13]，未见对刺梨槲皮素糖苷的鉴定及裂解途径分析的报道。

本研究采用超高效液相色谱串联高分辨质谱法（UPLCHRMS）解析刺梨槲皮素及其糖苷类化合物，根据标准品保留时间对照、相对分子质量、二级质谱碎片等信息对其进行定性研究，探究刺梨黄酮中可能存在的槲皮素糖苷组分及分布。黄酮是刺梨中重要功能成分，其中，游离态槲皮素和键合态槲皮素是主要成分。分析刺梨中槲皮素及其糖苷类物质的组成及结构特点，可为刺梨槲皮素糖苷结构鉴定提供参考，对提高刺梨利用率以及药用功效具有重要意义。

2实验部分

2.1仪器与试剂

Ultimate 3000超高效液相色谱仪Q Exactive Series高分辨质谱仪（UPLCHRMS，赛默飞世尔科技有限公司）; MilliQ Integral 5型超纯水仪（美国Merck Millipore公司）; KQ2200B型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）; BP211D型电子天平（德国Satorius集团）; DBS100部份收集器（上海琪特分析仪器有限公司）; RE5286A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

无水乙醇、石油醚（分析纯，济南明星化工有限公司）; HCl、NaOH（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）; 甲醇（色谱纯，美国Tedia公司）。标准品：槲皮素（98.0%）、槲皮素3O鼠李糖苷（98.0%）、槲皮素3O葡萄糖苷（98.0%）（上海源叶生物科技有限公司）; 槲皮素3O葡萄糖鼠李糖苷（98.0%，贵州迪大生物科技有限责任公司）。HPD600大孔树脂（南开大学化工厂）。刺梨（贵龙5号品种）采摘于贵州省龙里县，新鲜洁净，大小均匀，无霉烂，清洗沥干后，去蒂、

2.2实验方法

2.2.1于

20℃刺梨鲜果肉，真空冷冻干燥后粉碎，过60目分样筛，称取适量刺梨粉于锥形瓶中，按料液比 1∶20 （w/V）加入70%乙醇，在功率为300 W、温度50℃条件下超声40 min， 按料液比 1∶3 （w/V）加入石油醚浸渍30 min，去除脂溶性色素，4000 r/min 离心5～10 min，收集上清液，加入到预处理好的HPD600树脂层析柱，进行纯化富集，用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH调节上样液至pH 5.5，以1 mL/min速率上样，吸附3.5 h后，用pH 4.5的70% 乙醇溶液以1 mL/min速率进行洗脱。收集洗脱液，得纯化样品液，旋转蒸发浓缩后，经0.22 μm有机微孔膜过滤，供UPLCHRMS分析用。

2.2.2标准溶液的制备分别称取4.5 mg槲皮素、 5.0 mg槲皮素3O葡萄糖鼠李糖苷、5.0 mg槲皮素3O鼠李糖苷和5.0 mg 槲皮素3O葡萄糖苷固体标准品，用甲醇溶解并定容至25 mL，得到浓度分别为0.18、0.20、0.20和0.20 mg/mL的标准品储备液，分别吸取0、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 mL，定容至20 mL，经微孔滤膜（0.45 μm）过滤，备用。

2.2.3UPLCHRMS测定条件色谱条件： Hypersil GOLD aQ色谱柱（100 mm×2.1 mm， 1.9 μm）; 柱温为35℃; 自动进样器温度为15℃; 流速为0.2 mL/min; 进样体积为2 μL; 流动相A为甲醇，流动相B为水。梯度洗脱： 0～2 min，80% B; 2～20 min，80%～10% B; 20～22 min，10% B; 22～23 min，90% B。

质谱条件： 加热的电喷雾离子源（HESI），负离子模式进行检测; 喷雾电压3.2 kV; 毛细管温度320℃; 加热器温度350℃; 鞘气 （N2） 流速35 arb; 辅助气 （N2） 流速10 arb; 掃描模式为一级质谱全扫描结合自动触发二级质谱扫描模式（Full scan/ddMS2）; 扫描范围m/z 100～1500; 一级质谱分辨率70000，二级质谱分辨率为 17500; 归一化碰撞能量（NCE）为20、40和60 eV。

3结果与讨论

刺梨中黄酮类化合物含较多羟基，可形成稳定的氧负离子，在质谱负离子检测模式下有较好的信号响应[14]。采用负离子检测模式，使总离子流色谱图有较低的背景值，可形成的母离子通常为[M-H]

4结 论

利用超高效液相色谱串联高分辨质谱法对刺梨中槲皮素及其糖苷类化合物样品解析，共鉴定出1种槲皮素与9种含有槲皮素母核结构物质，其中可确定化学组成的物质有槲皮素、槲皮素3O鼠李糖苷、槲皮素3O葡萄糖苷、槲皮素3O[6"O（3羟基3甲基戊二酰）βD半乳糖苷]和槲皮素3O葡萄糖鼠李糖苷，根据离子碎片推断槲皮素糖苷裂解途径。本研究全面分析了刺梨黄酮种类，补充了刺梨原料基础信息，为刺梨功能的挖掘及其黄酮类化合物功效的深入研究和开发利用提供了理论参考。

References

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