豌豆蚜触角转录组化学感受蛋白的鉴定、表达和结合特性分析

刘靖涛, 王 倩, 赵 瑞, 王欢欢, 高 洁, 董 辉,张永军, 丛 斌,*， 谷少华,*

(1. 沈阳农业大学植物保护学院, 沈阳 110866; 2. 中国农业大学昆虫学系, 北京 100193; 3. 中国农业科学院植物保护研究所, 植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100193)

蚜虫自身可以分泌产生两大类信息素，报警信息素和性信息素。蚜虫报警信息素最早报道于1972年，其主要有效成分为(E)-β-法尼烯[(E)-β-farnesene, EβF]。已经测定的59种蚜虫中， 41个种的报警信息素是EβF (Bowersetal., 1972; Xiangyuetal., 2002)。蚜虫可以通过报警信息素进行种群间个体的交流，进而能够有效躲避环境中的有害因子如天敌的捕食(Bowersetal., 1972; Pickett and Griffiths, 1980; Pickettetal., 1992; Yuetal., 2012)。在越来越多的田间和行为学实验研究中，EβF被应用到了蚜虫绿色防控中(Pickett and Griffiths, 1980; Yuetal., 2012)。研究蚜虫识别报警信息素、性信息素和寄主植物挥发物的分子和行为机制，可以为开发基于嗅觉行为调控的蚜虫防控策略提供理论基础。昆虫的化学感受蛋白(chemosensory protein, CSP)是一种与化学感受相关的可溶性蛋白，其与疏水性化合物结合并将其运输到特定位置，在嗅觉识别中发挥作用，在昆虫抗药的过程中发挥作用(Liuetal., 2014)，参与昆虫生理节律的调节及变化(Guoetal., 2011)，调控昆虫的发育(Stathopoulosetal., 2002)等。

豌豆蚜Acyrthosiphonpisum是一种重要的农业害虫，属蚜科(Aphididae)无网管蚜属Acyrthosiphon，可为害豌豆Pisumsativum和苜蓿Medicagosativa等多种豆科植物(Ogawa and Miura, 2014; 张丽和袁明龙, 2017)。豌豆蚜通过孤雌生殖方式在生长季快速大量繁殖，在越冬时期采取有性生殖方式抵御低温环境。因此，通过识别性信息素来寻找配偶交配，对于豌豆蚜完成生活史来说是十分重要的。性信息素主要成分为(+)-(4aS,7S,7aR)-荆芥内酯和(-)-(1R,4aS,7S,7aR)-荆芥醇，于1987年在巢菜修尾蚜Megouraviciae中首次被鉴定出来(Dawsonetal., 1987)。不同于报警信息素从腹管中分泌，蚜虫的性信息素是从雌虫的后腿胫节的腺体上分泌的(Marsh, 1972; Pickett and Glinwood, 2007)。

目前关于蚜虫CSPs在参与蚜虫报警信息素和性信息素通讯中的作用还未见报道。本研究通过豌豆蚜触角转录组测序、RPKM值分析、半定量RT-PCR组织表达谱分析、体外表达和荧光竞争结合实验，测定了在豌豆蚜触角中高表达的3个CSPs同蚜虫报警信息素和性信息素以及植物挥发物的结合能力，为蚜虫CSP蛋白参与蚜虫报警信息素和性信息素通讯过程提供了证据支持。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

豌豆蚜采自中国农业科学院植物保护研究所廊坊科研中试基地的豌豆植株上，室内在人工气候箱中用养虫笼(40 cm×40 cm×40 cm)饲养于蚕豆Viciafabae苗上。饲养条件：温度26±1℃、相对湿度70%±5%、光周期16L∶8D。

蚜虫报警信息素主要组分EβF，微量组分(-)-α-蒎烯、(-)-β-蒎烯和(+)-柠檬烯以及8种植物挥发物购自Sigma-Aldrich(Sigma Co.,德国)，纯度>90%；蚜虫性信息素组分(+)-(4aS,7S,7aR)-荆芥内酯和(-)-(1R,4aS,7S,7aR)-荆芥醇纯度>95%，均由英国洛桑研究所周警疆教授提供。上述所有配体信息见表2。

1.2 豌豆蚜触角转录组测序和CSP基因鉴定

利用Trizol法提取豌豆蚜无翅成蚜(约1 000头)触角RNA。采用NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit(NEB Co., 美国)试剂盒构建豌豆蚜触角cDNA文库，通过Illumina Hiseq2500测序仪进行豌豆蚜虫触角转录组测序。测序完成后，去除低质量的raw reads, 得到clean reads。 采用Trinity软件对获得的clean reads进行拼接(Grabherretal., 2011)，拼接之后将每条基因中最长的转录本作为unigene。

在NCBI数据库中下载所有已知半翅目昆虫的CSP基因序列，构建本地化数据库，利用tBLASTn筛选豌豆蚜触角转录组中CSP基因序列。将筛选到的CSP基因序列人工校正其正确性。

1.3 触角转录组中ApisCSP基因表达量差异分析

采用每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数(reads per kilobase per million mapped reads, RPKM)(Mortazavietal., 2008)比较1.2节鉴定的ApisCSP基因在触角转录组中的表达量差异。

1.4 ApisCSP基因组织表达谱分析

Trizol法提取豌豆蚜成蚜不同组织(触角、口针、去除触角和口针的头、胸、腹、足和翅)的RNA。用SuperScript Ⅲ反转录酶(Invitrogen)合成cDNA第1链，3个生物学重复，每重复采集约1 000头成蚜。各cDNA模板均定量为150 ng/μL。采用半定量RT-PCR检测1.2节鉴定到的ApisCSP基因的组织表达谱。基于1.2节鉴定到的ApisCSP基因序列，用Primer Premier 5设计RT-PCR引物(表1)。豌豆蚜的β-actin(GenBank 登录号: NP_001136108)为内参基因。PCR反应体系(50 μL): ddH2O 35.75 μL,ExTaqBuffer 5 μL, dNTPs 4 μL, cDNA第1链 1 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各2 μL,ExTaqDNA Polymerase 0.25 μL。PCR反应条件: 95℃ 2 min; 95℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35个循环; 72℃ 10 min。每组织3个生物学重复，每样品至少重复测定6次。

表1 引物信息

1.5 豌豆蚜CSP序列分析和进化树构建

从NCBI数据库中下载目前已知的所有蚜虫的气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP)基因和CSP基因序列。OBP和CSP蛋白信号肽预测使用SignalIP-5.0 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)(Petersenetal., 2011)。利用软件ClustalX 2.1(Larkinetal., 2007)进行序列比对，参数设置如下：Gap opening=10，Extension=0.2。比对完后用GeneDoc 2.7.0进行编辑。每对CSP之间序列相似比通过Vector NTI 11.5(Invitrogen Corporation, Carlsbad, USA)来计算。从NCBI数据库中下载获得16种蚜虫(不限于触角)的OBP基因85个，CSP基因41个，构建进化树。

由于用于构建进化树的OBP和CSP的氨基酸序列一致性非常低(分别为10.5%和21.6%)，所以序列比对采用PRANK比对软件(Löytynoja and Goldman, 2010; Wangetal., 2019)，进化树构建采用RaxML version 8中的最大似然法(Stamatakis, 2014)。通过ProtTest 3(Darribaetal., 2011)预测建树的最佳模型为LG替换矩阵，重复构建1 000次。

1.6 ApisCSP2/4/5蛋白的表达和纯化

根据ApisCSP2/4/5蛋白编码区(CDS)序列，设计特异性引物(表1)，并在正反向引物中分别设计了NdeI/EcoR I酶切位点(以下划线表示)。以豌豆蚜触角cDNA为模板，用Easy A High-fidelity PCR高保真酶(Stratagene, La Jolla, CA, 美国)扩增ApisCSP2/4/5的CDS序列，PCR产物经胶回收后连接到pGEM-T Easy载体上(Promega， Madison, WI, 美国)，转化到大肠杆菌EscherichiacoliDH5α感受态细胞。序列验证正确后，将重组质粒pGEM/ApisCSP2/4/5与表达载体PET-30a(+)(Novagen, Madison, WI, 美国)连接，转化到BL21(DE3)感受态细胞，通过IPTG(1 mmol/L) 28℃摇床中诱导8 h后，8 000×g离心10 min收集菌体，然后用裂解液(80 mmol/L Tris-HCl, 200 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 4%甘油, 0.5 mmol/L PMSF, pH 7.2)裂解细胞沉淀，经超声波处理和高速离心后，分别收集上清和沉淀中的包涵体。用含0.2% Triton X-100的50 mmol/L Tris Buffer (pH 6.8)对不溶的包涵体冲洗，然后溶解在6 mol/L的盐酸胍中，包涵体的复性和重折叠采用氧化还原法(Prestwich, 1993)。

利用HiTrap Q HP Columns，Mini Q 4.6/50 Anion Exchange Column，HiTrap Desalting Columns和Superdex 75 10/300 GL Column (GE Healthcare Biosciences, Uppsala, 瑞典)对重折叠好的蛋白进行离子交换、分子筛、浓缩、脱盐等步骤纯化。SDS-PAGE鉴定纯化的ApisCSP2/4/5蛋白的纯度及分子量大小。以牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)为标准蛋白，采用Bradford法(Bradford, 1976)对纯化并浓缩好的ApisCSP2/4/5蛋白进行浓度测定。

1.7 荧光竞争结合实验

将纯化后的ApisCSP2/4/5用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)稀释到1 mg/mL；配体化合物(表2)及荧光探针1-NPN(Sigma Co., 德国) 分别溶于甲醇溶液中，配成1 mmol/L 的母液备用。使用F-380分光光度计(天津港东，天津)测定目的蛋白与1-NPN的结合曲线: 向50 mmol/L Tris-HCl中加入终浓度为2 μmol/L目的蛋白，然后依次加入荧光探针1-NPN至终浓度分别为2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18和20 μmol/L，充分混匀并反应30 s后测定和记录其荧光强度并计算蛋白与1-NPN的结合常数Ki。然后测定目的蛋白与配体的结合常数: 加入2 μmol/L蛋白溶液和2 μmol/L荧光探针1-NPN，在相同条件下记录初始荧光值，再将被测配体分别按终浓度2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18和20 μmol/L的梯度加入到1-NPN和目的蛋白的混合液中，每次混匀后反应30 s，记录荧光值。每样品实验重复3次。假设ApisCSP蛋白的活性为100%，且在饱和状态下目的蛋白与配体分子以1∶1的比例相结合，根据IC50值(ApisCSP/1-NPN复合物的荧光强度值下降一半时配体气味分子的浓度)，计算ApisCSPs和配体分子的结合常数Ki。计算公式：Ki=[IC50]/(1+[1-NPN]/K1-NPN)，其中[1-NPN]为未结合的1-NPN的浓度，K1-NPN为ApisCSP/1-NPN复合物的结合常数。当CSP蛋白同配体的结合常数Ki<5 μmol/L时，认为CSP同该配体结合能力很强；当5 μmol/L10 μmol/L时，结合能力较弱(Wangetal., 2021)。

表2 重组蛋白ApisCSP2/4/5与配体的结合能力

2 结果

2.1 豌豆蚜触角转录组中CSP基因鉴定

豌豆蚜触角转录组测序共得到134 439 894条raw reads，清除带接头和低质量的序列后得到131 215 742条clean reads，测序通量为13.12 G，测序深度28.28倍，Q20值为98.12%。序列进行组装后产生32 796条unigenes，长201～20 423 bp，平均长921 bp，N50值和N90值分别为1 634和344 bp。

通过CSP Motif“C1-X6-8-C2-X16-21-C3-X2-C4”分析和本地化tBLASTn比对，在豌豆蚜触角转录组中共鉴定到10个CSP基因，其开放阅读框长369～681 bp。所有的CSP基因序列都通过克隆和测序得到了验证。我们将豌豆蚜CSP基因与已报道的棉蚜Aphisgossypii(Guetal., 2013)、麦长管蚜Sitobionavenae(Xueetal., 2016)和桃蚜Myzuspersicae(Wangetal., 2019) CSP 序列进行了同源比对，根据其同源性命名为ApisCSP1-10(GenBank登录号: OK392085-OK392094)。相对于桃蚜和棉蚜，豌豆蚜虫多了一个CSP3基因。ApisCSP1无信号肽，其余ApisCSPs在其N端都有信号肽。所鉴定的ApisCSPs序列特征均符合昆虫CSP序列模式“C1-X6-8-C2-X16-21-C3-X2-C4”。

2.2 豌豆蚜触角转录组中CSP序列和进化树

经序列比对后发现，豌豆蚜10个CSPs的氨基酸序列同桃蚜CSPs的序列一致性非常高，为66%～90%。进化树表明，蚜虫OBPs和CSPs两类气味结合蛋白位于两个明显不同的分支，表明蚜虫OBPs和CSPs在进化起源上的不同。蚜虫CSPs可以明显分成9个亚家族，每个亚家族的CSPs在不同的蚜虫之间显示出非常高的同源性(图1)。

图1 最大似然法构建的基于氨基酸序列的蚜虫OBPs和CSPs的系统发育树(1 000次重复)

2.3 豌豆蚜触角转录组中ApisCSP基因的RPKM值和组织表达谱

RPKM值表明，本研究鉴定得到豌豆蚜10个触角ApisCSP基因中，ApisCSP2,ApisCSP4和ApisCSP5在触角中的表达量最高，RPKM值分别是1 274, 315和443。其余7个CSP基因的RPKM值较低，在20～159之间(图2)。

半定量RT-PCR结果发现，这10个ApisCSP基因在豌豆蚜成蚜不同的组织中均有表达，但是只有ApisCSP2,ApisCSP4和ApisCSP5同时在触角、口针、足和翅中高表达(图2)。

图2 基于RPKM值分析的ApisCSP1-10在豌豆蚜成蚜触角中的表达量和半定量RT-PCR分析的其在成蚜不同组织中的表达量

2.4 豌豆蚜ApisCSP2/4/5的重组表达

基于触角转录组RPKM值分析和半定量RT-PCR结果，我们选定3个表达量最高的ApisCSP2, ApisCSP4和ApisCSP5进行体外原核表达和纯化。SDS-PAGE检测结果表明3个CSP重组蛋白与大多数昆虫OBPs和CSPs一样，都集中在包涵体中表达，最终得到高纯度的ApisCSP2, ApisCSP4和ApisCSP5重组蛋白(图3)，用于进行后续的功能测定。

图3 ApisCSP2/4/5重组蛋白的SDS-PAGE分析

2.5 重组蛋白ApisCSP2/4/5的配体结合特性

通过Scatchard方程得出，豌豆蚜ApisCSP2, ApisCSP4和ApisCSP5与荧光探针1-NPN的结合常数Ki分别为5.87±0.81, 1.87±0.62和2.32±0.49 μmol/L(图4)。

图4 重组蛋白ApisCSP2/4/5与1-NPN的结合曲线(A)和斯卡查德图(B)

荧光竞争结合实验结果表明，ApisCSP4与报警信息素主要组分(E)-β-法尼烯和微量组分(-)-α-蒎烯结合能力强，最大竞争结合力分别是21.2%±1.9%和45.5%±3.1%，Ki值分别为2.2±0.8和4.9±0.7 μmol/L，与另外2种微量组分(-)-β-蒎烯、(+)-柠檬烯结合能力较弱，最大竞争结合力>50%，Ki>10 μmol/L；而ApisCSP2和ApisCSP5同4种报警信息素组分结合能力都比较弱，最大竞争结合力>50%，Ki>10 μmol/L(图5; 表2)。ApisCSP2和ApisCSP4与性信息素组分(+)-(4aS,7S,7aR)-荆芥内酯和(-)-(1R,4aS,7S,7aR)-荆芥醇都不结合，IC50值均大于50 μmol/L。ApisCSP5与(+)-(4aS,7S,7aR)-荆芥内酯和(-)-(1R,4aS,7S,7aR)-荆芥醇显示出强结合能力，最大竞争结合力分别是39.4%±3.2%和32.9%±3.3%，Ki值分别为4.8±0.9和2.6±0.6 μmol/L(图5； 表2)。

图5 重组蛋白ApisCSP2/4/5与蚜虫报警信息素和性信息素的结合曲线

3个CSP蛋白与8种植物挥发物结合力检测结果显示，ApisCSP2的结合谱最窄，只与顺-3-己烯醇和乙酸叶醇酯有弱结合能力，Ki值分别为15.1±1.5和28.5±2.7 μmol/L，与另外6种挥发物不结合，IC50值均大于50 μmol/L；ApisCSP4结合谱中等，能够强结合己酸己酯和香叶醇，Ki值分别为4.8±1.1和4.2±0.7 μmol/L，中等结合橙花叔醇，Ki值为5.8±0.8 μmol/L，与另外5种植物挥发物不结合，IC50值均大于50 μmol/L；ApisCSP5的结合谱最广，与反-2-己烯醛、己酸己酯、香茅醇、顺-3-己烯醇、香叶醇都能够强结合，Ki值均小于5 μmol/L，与橙花叔醇结合力中等，Ki值为7.9±1.7 μmol/L，ApisCSP5不结合乙酸叶醇酯和芳樟醇，IC50大于50 μmol/L(图6； 表2)。

图6 重组蛋白ApisCSP2/4/5与植物挥发物的结合曲线

3 讨论

本研究中，在转录组水平鉴定了10个豌豆蚜触角CSP基因，通过半定量RT-PCR检测和转录组RPKM值分析的方法进行了基因表达量分析，对豌豆蚜触角中高表达的3个CSP基因ApisCSP2,ApisCSP4和ApisCSP5进行了体外表达和纯化(图3)，体外结合实验表明，ApisCSP4与蚜虫报警信息素主要组分EβF结合能力最强，Ki值为2.2±0.8 μmol/L(图5; 表2)，另外ApisCSP4与蚜虫报警信息素微量组分(-)-α-蒎烯也有着强结合能力，Ki值为4.9±0.7 μmol/L(图5; 表2)，表明ApisCSP4可能是豌豆蚜识别报警信息素的主要蛋白，基于蚜虫CSP4亚家族在不同蚜虫之间的高度同源性(图1)，推测在其他蚜虫中CSP4蛋白也参与报警信息素的识别，在蚜虫报警信息素通讯过程中起着同OBP3/7/9类似的运输功能(Wangetal., 2021)。而豌豆蚜的ApisCSP2和ApisCSP5没有表现出与蚜虫报警信息素主要组分EβF或微量组分强结合能力，ApisCSP2的结合谱非常窄，和测试的8种植物挥发物结合能力非常弱，表明其主要功能不是嗅觉功能，可能参与其他生理功能。

蚜虫的性信息素从成熟雌性后足的胫节中释放(Marsh, 1972; Pickett and Glinwood, 2007)，包括两种组分(+)-(4aS,7S,7aR)-荆芥内酯和(-)-(1R,4aS,7S,7aR)-荆芥醇(Pickettetal., 1992; Dewhirstetal., 2008)，不同物种间这两种组分的比例各不相同，在桃蚜中二者的比例为1∶1.5(Dawsonetal., 1990)。之前我们系统研究了蚜虫的OBPs的体外功能，发现均不能够结合上述两种性信息素分子(Wangetal., 2021)。在本研究中，我们发现豌豆蚜CSP5能够与上述两种性信息素组分强结合，Ki值分别为4.8±0.9和2.6±0.6 μmol/L(图5；表2)，暗示ApisCSP5可能参与秋季有性生殖豌豆蚜性信息素释放和识别的过程。同时，ApisCSP5在3个测定的CSPs中表现出最广的结合谱，其也能够同植物挥发物反-2-己烯醛、己酸己酯、香茅醇、顺-3-己烯醇、香叶醇强结合，Ki值均小于5 μmol/L。表明ApisCSP5也同时参与蚜虫的寄主识别或转移过程。然而上述结果仅仅是基于体外功能测定，后续还需要通过活体功能测定如RNAi或基因编辑实验确定ApisCSP4和ApisCSP5在蚜虫报警信息素和性信息素通讯中的生物学功能。