沙葱萤叶甲成虫触角感器超微结构及对沙葱挥发物的触角电位反应

李 玲, 李 娜, 庞保平

(1. 内蒙古农业大学草原昆虫研究中心, 呼和浩特 010020; 2. 鄂尔多斯市农牧业技术推广中心, 内蒙古鄂尔多斯 017200)

沙葱萤叶甲Galerucadaurica属于鞘翅目(Coleoptera)叶甲科(Chrysomelidae)萤叶甲亚科(Galerucinae)，是一种近年来在内蒙古草原上猖獗成灾的新害虫，为寡食性害虫，主要危害沙葱Alliummongolium、野韭A.ramosum、多根葱A.polyrhizum等百合科(Liliaceae)葱属Allium植物，其中沙葱是其最适寄主(昊翔等, 2014)。该虫一年发生1代，幼虫和成虫均能危害葱属植物茎叶，其中以春季幼虫为害最重，严重影响当地农牧民的生产生活，并对草原生态环境和畜牧业可持续发展构成严重威胁。老熟幼虫和成虫分别有聚集于石块、牛粪及杂草丛下化蛹和滞育越夏的习性(昊翔等, 2015)。一般认为，嗅觉在昆虫的取食和聚集等生命活动中起着至关重要的作用(Fieldetal., 2000; Asahinaetal., 2008)。目前对嗅觉系统在沙葱萤叶甲寄主植物选择及聚集过程中的作用知之甚少。因此，急需开展沙葱萤叶甲嗅觉感受及其机理的研究，而了解触角感器的结构及触角电位反应是研究嗅觉系统的基础。

昆虫触角上不同类型的感受器是昆虫识别挥发性化学信号的基本结构。昆虫的感受器是由体壁表皮特化形成的，是感受外界信息的最基本的结构单元，感受器的形态学和结构的观察是感器功能研究的基础。触角感器根据其表皮突的外观可分为：毛形感器(sensilla trichodea)、锥形感器(sensilla basiconica)、刺形感器(sensilla chaetica)、腔锥形感器(sensilla coeloconica)等(Schneider, 1964)。感受器淋巴液中分布着一个或多个嗅觉受体神经元(olfactory receptor neuron, ORN)。ORN具有两极，其中一极为神经元树突，伸向触角感受器的顶端，其膜上分布着能特异性识别气味分子的嗅觉受体(olfactory receptor, OR)，且OR将接受到的化学信号转化为电生理信号；另一极为伸向联系神经元的轴突，轴突将电生理信号传递至触角神经叶放大处理，最终传递至大脑(Jacquin-Joly and Merlin, 2004)。大脑将电生理信号加工整合后发出指令，进而通过运动神经元调控昆虫的行为反应(Kriegeretal., 1993)。国内外学者对鞘翅目许多昆虫的触角感器及电生理反应进行了研究，如：斑鞘豆叶甲Colposcelissignata的触角感器类型有8种，包括毛形感器Ⅰ型和Ⅱ型、刺形感器、锥形感器、指形感器、腔锥形感器、栓锥形感器Ⅰ型和Ⅱ型、钟形感器和Böhm氏鬃毛(徐伟等, 2020)。马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata成虫触角着生感器主要为毛形感器、锥形感器、腔形感器和Böhm氏鬃毛(刘丽玲等, 2021)。张萌萌等(2020)通过电生理及行为生测试验发现反-3-己烯醇和顺-3-己烯醇对东方绢金龟Maladeraorientalis雌成虫具有显著的吸引作用。铜绿丽金龟Anomalacorpulenta对水杨酸甲酯有显著的电生理反应(鞠倩等, 2016)。

本研究通过扫描电子显微镜初步观察了沙葱萤叶甲成虫触角上感受器的类型和分布特点，应用气谱-质谱联用仪(GC-MS)鉴定了其最适寄主植物——沙葱的挥发物组分，并利用触角电位技术(electroantennography, EAG)测定了沙葱萤叶甲成虫对寄主植物主要挥发性气味物质的电生理反应，以期为进一步揭示沙葱萤叶甲的化学感受机理，并为研发以行为调控为基础的沙葱萤叶甲绿色防控技术提供必要的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试昆虫：沙葱萤叶甲3龄幼虫于2017年采自内蒙古锡林郭勒盟镶黄旗，在人工气候箱中以沙葱饲喂至成虫，羽化后立即将雌雄成虫分开饲养，选择3日龄成虫进行试验。饲养条件：温度26±1℃，光周期16L∶8D，相对湿度60%～80%。

1.1.2供试植物：寄主植物沙葱于2017年采自内蒙古锡林浩特市，移栽到花盆中在室内培养。

1.2 触角感器类型的观察及鉴定

在解剖镜下用手术刀分别切下雌、雄成虫的触角各3根，将其浸入70%的酒精中，用超声波清洗仪清洗2次，每次10 min。然后在70%, 80%, 90%及100%的不同浓度梯度酒精中进行逐级脱水，自然干燥24 h。将干燥的触角用导电胶粘到样品台上，喷金后使用日立S-530型扫描电子显微镜观察并拍照。根据Schneider (1964)的触角感器分类方法，确定沙葱萤叶甲雌雄成虫触角上分布的感器类型。

1.3 沙葱挥发物成分的鉴定

采用顶空动态吸附收集法采集沙葱挥发物。调节气流计流速0.5 L/min，采集时间6 h，重复收集2次，每次设置一个空白对照。玻璃管吸附柱(内径3.5 mm)内填充的吸附剂为Super Q(美国Alltech公司)，采集完毕后取下吸附管，用重蒸二氯甲烷(>99.99%)将吸附管中的样品淋洗于样品瓶中，将瓶口密封后在-20℃冰箱中保存，待检测。

利用气相色谱质谱联用仪GC(7890B)-MS(5977A)(Agilent，美国)对收集到的沙葱挥发物样品进行定性和相对定量分析。样品进样量3 μL，进样口温度250℃，无分流进样。色谱柱为HP-5MS，设置升温程序：40℃ 2 min，以6℃/min的速率上升至250℃，保持2 min。柱气流量为1.0 mL/min，气谱/质谱接口温度为280℃。通过检索库Mass Hunter确定挥发物组分。

1.4 触角电位反应

使用重蒸二氯甲烷将二烯丙基硫醚、1,3-二噻烷、二甲基三硫醚、二烯丙基二硫、二烯丙基三硫醚、二甲基二硫醚、顺-2-己烯-1-醇、月桂烯、2-己烯醛、苯甲酸甲酯、己醛、环庚三烯和对二甲苯13种气味标准品(均购自Sigma-Aldrich公司)分别配制成1 mol/L，测定沙葱萤叶甲成虫对不同气味化合物的触角电位反应，以二氯甲烷为溶剂对照。另外，将二烯丙基硫醚、顺-2-己烯-1-醇、2-己烯醛、苯甲酸甲酯、己醛和二烯丙基二硫6种气味化合物分别配制成1， 0.1， 0.01, 0.001, 0.0001和0.00001 mol/L 6个浓度梯度，测定沙葱萤叶甲成虫对不同浓度化合物的触角电位反应。

用手术刀将羽化3 d的沙葱萤叶甲成虫触角切下，再将触角端部切去少许。用导电胶将其固定在两个金属电极之间。剪取1 cm×0.5 cm的滤纸片，滴加10 μL的待测样品后放入巴斯德管中，待基线平稳后踩踏脚踏板，记录响应值。每个样品测试雌雄触角各6根(生物学重复)。

1.5 数据分析

在SPSS软件中对触角电位反应值进行数据分析。雌雄之间差异显著性分析采用成对样本t检验，显著水平为0.05；不同化合物及不同浓度之间差异显著性分析所用方法为单因素方差分析，Duncan氏检验方法，显著水平为0.05。

2 结果

2.1 沙葱萤叶甲成虫触角基本形态特征、感器类型及分布情况

沙葱萤叶甲雌雄成虫触角均为线状，共11节，由柄节、梗节和鞭节组成。通过扫描电子显微镜观察发现柄节和梗节表皮较为平滑，感器分布较少。鞭节表皮呈鱼鳞状，分布着大量感器，且从第1节到末节感器数量逐渐增多。

沙葱萤叶甲触角上分布的感器类型主要有5种，分别是Böhm氏鬃毛(Böhm bristles, BB)、毛形感器(sensilla trichodea, ST)、刺形感器(sensilla chaetica, SC)、锥形感器(sensilla basiconica, SB)和钟形感器(sensilla campaniformia, SCa)。此外，在触角表面还发现许多表皮孔(epidermal pore, P)，触角各节均有分布。

2.1.1Böhm氏鬃毛：Böhm氏鬃毛(BB)呈刺状垂直于触角表面，基部深陷于触角表皮内，成簇地着生于柄节和梗节基部，每簇约15根左右，长度为9.3～11.32 μm(图1: A和B)。

图1 沙葱萤叶甲成虫触角感器类型

2.1.2毛形感器：毛形感器根据形态和大小可分为3类，即毛形感器1、毛形感器2和毛形感器3。

毛形感器1(ST1)呈长毛状，基部到端部逐渐变尖细，近端部弯曲呈弧形，与触角表面形成角度较小，多成匍匐状。长度为95.24～123.81 μm，主要分布在梗节和柄节(图1: B)。

毛形感器2(ST2)细长呈针状，径直向前，与触角表面呈30～40°，长约28.05～47.56 μm，具有明显的纵纹。主要分布在鞭节，基部位于鳞片缝隙中，数量较多(图1: C)。

毛形感器3(ST3)长度较短，尖细如刺，表面光滑，长度约为9.76～14.63 μm。主要分布在鞭节第5～9节(图1: C)。

2.1.3刺形感器：刺形感器(SC)与毛形感器2形状相似，但其端部较为钝圆。着生于触角表皮的凹穴内，与触角表面呈60°左右夹角，明显高于其他类型感器。长度为44.44～74.07 μm，主要分布在鞭节，在鞭节末节顶端分布最密(图1: C和E)。

2.1.4锥形感器：锥形感器(SB)比毛形感器和刺形感器都短，其表面光滑，端部钝圆(图1: D)。根据形态可分为锥形感器1(SB1)和锥形感器2(SB2)。零散分布于鞭节第6-9节，数量较少。

锥形感器1(SB1)顶端钝圆，基部向端部逐渐变细，向前弯曲如指状，长度为11.56 μm，与锥形感器2相比更为尖细。

锥形感器2(SB2)着生于四周表皮隆起的凹窝内，表面光滑，端部钝圆，近圆柱形，长度为10.67 μm。

2.1.5钟形感器：钟形感器(SCa)边缘隆起略高于触角表皮，中间呈锥形突起。在雌雄触角鞭节最后1节均只发现1个此类感器(图1: F)。

2.2 沙葱挥发物成分分析

采用顶空动态收集法和GC-MS技术测定了沙葱的挥发物成分。结果显示，沙葱挥发物主要由32种化合物组成(表1)，其中，含量最高的为二烯丙基二硫，其次为烯丙基甲基二硫醚，这两个组分均为含硫化合物，占总量的43.16%；其他组分相对含量均不到10%。 含硫化合物共有9种，占总量的49.3%。

表1 沙葱挥发物组分及含量

2.3 沙葱萤叶甲成虫对沙葱挥发物的触角电位反应

从沙葱挥发物中挑选了13种化合物分别配制成1 mol/L进行触角电位试验。从图2中可看出，雌成虫对二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫、顺-2-己烯-1-醇、2-己烯醛、苯甲酸甲酯和己醛表现出较强的触角电位反应，EAG值均大于0.5 mV，其中对2-己烯醛的触角电位反应最为强烈，显著高于对其他化合物；雄成虫对2-己烯醛和二烯丙基二硫也表现出较强的触角电位反应，EAG反应值大于0.5 mV。除二甲基二硫醚和对二甲苯外，雌成虫对多数气味化合物的EAG反应值均高于雄成虫，且雌成虫对二烯丙基硫醚的触角电位反应值显著高于雄成虫(P<0.05)，对其余气味化合物的EAG值在雌雄之间差异不显著(P>0.05)。

图2 沙葱萤叶甲成虫对寄主植物挥发物(1 mol/L)的触角电位反应

从沙葱萤叶甲成虫对不同气味化合物的触角电位试验中筛选了6种反应值较强的化合物，包括二烯丙基硫醚、顺-2-己烯-1-醇、2-己烯醛、苯甲酸甲酯、己醛和二烯丙基二硫，将其稀释成不同浓度梯度，检测沙葱萤叶甲成虫对不同浓度的这6种化合物的触角电位反应。结果显示(图3)，随着二烯丙基硫醚浓度的增加，雌雄成虫的EAG反应值均呈上升趋势，且在浓度为0.1和1 mol/L时雌雄成虫的EAG值显著高于对其他浓度梯度的EAG值(P<0.05)，当二烯丙基硫醚浓度在0.01 mol/L时，雌雄之间的EAG反应值存在显著性差异(P<0.05)。顺-2-己烯-1-醇在0.01 mol/L浓度下时成虫的EAG值下降，之后随着浓度的增加EAG值逐渐上升；沙葱萤叶甲成虫对0.1 mol/L 2-己烯醛的触角电位反应最强，EAG值显著高于对其他浓度梯度2-己烯醛的(P<0.05)，雌雄之间差异不显著(P>0.05)。苯甲酸甲酯浓度为0.1 mol/L时，沙葱萤叶甲雌成虫的EAG值最高，显著高于对0.001 mol/L苯甲酸甲酯(P<0.05)，雄成虫对不同浓度苯甲酸甲酯的EAG值均无显著差异(P>0.05)。沙葱萤叶甲成虫对己醛的EAG值随着浓度的增加呈上升趋势，在1 mol/L时，EAG值最高，显著高于对其他浓度梯度(P<0.05)，其次为0.1 mol/L，各浓度下雌雄之间的EAG值无显著差异(P>0.05)。二烯丙基二硫在浓度为0.01 mol/L时，沙葱萤叶甲成虫的EAG值达到饱和之后不再上升，在0.01～1 mol/L浓度之间时，沙葱萤叶甲成虫的EAG值显著高于对其他低浓度梯度的EAG值(P<0.05)，雌雄之间的EAG值差异不显著(P>0.05)。总体来说，当化合物浓度为1 mol/L时，测试的这6种化合物(除2-己烯醛外)均能激发沙葱萤叶甲成虫产生最强的触角电位反应。

图3 沙葱萤叶甲成虫对不同浓度化合物的触角电位反应

3 讨论

鞘翅目昆虫常见的触角感器有毛形感器、刺形感器、锥形感器及板形感器等。本研究首次对沙葱萤叶甲成虫触角进行了扫描电镜观察，发现沙葱萤叶甲成虫触角上具有毛形感器、刺形感器、锥形感器、钟形感器和Böhm氏鬃毛共5种类型感器，其中，毛形感器分布最广、数量最多(图1)。有研究表明，油菜蓝跳甲Psylliodeschrysocephala的毛形感器表皮壁较厚，壁上有毛孔，具有触觉和嗅觉功能(Bartletetal., 1999)。在许多鳞翅目昆虫中，毛形感器被证明与性信息素的特异性识别有关。例如，利用单感器记录技术表明雄蛾触角上的毛形感器对雌蛾释放的性信息素相关化合物很敏感(Maidaetal., 2000; Pophofetal., 2005; Wuetal., 2015)。此外，毛形感器也被证明参与寄主植物挥发物的识别(Andersonetal., 2009; Tanakaetal., 2009)。刺形感器在触角上的着生特点是，无论在什么位置都直立于触角表面，并且比其他感器明显高出许多，这一形态特点易于首先接触到物体，因而被认为具有感受机械刺激的功能(Schneider, 1964)。一些研究发现刺形感器表皮壁较厚，具有顶孔，存在感觉神经元树突，推测其可能具有味觉功能(Maetal., 2016)。棉铃虫Helicoverpaarmigera触角上的刺形感器对果糖反应敏感，且对果糖有特异性反应的味觉受体HarmGR4在刺形感器中表达(Jiangetal., 2015)。锥形感器也是昆虫触角上常见的感器类型，是典型的嗅觉感器类型，其作用主要是感受和识别寄主植物挥发物和环境中的其他信息化合物。前人通过原位杂交和免疫组织化学等技术，发现许多昆虫的嗅觉相关蛋白在锥形感器中特异性表达或高表达，且对寄主植物挥发物具有很强的结合能力(Xuetal., 2013; Zhangetal., 2013; Sunetal., 2014, 2015)。目前对钟形感器的研究较少，一般认为钟形感器为有孔结构，感受器穿过表皮而伸出，与腔锥感器有联系，对气味、二氧化碳、温湿度敏感；也有一些学者认为钟形感器没有孔，表皮呈蘑菇状突起插入表皮圆柱状凹陷内，是一种温湿度感器。有研究表明歩甲Pterostichusaethiops触角钟形感器中的感觉细胞A对低温较为敏感(Meriveeetal., 2003)。Böhm氏鬃毛是一种感受重力的机械感器，当遇到机械刺激时，能够缓冲重力的作用力，从而控制触角位置下降的速度(Schneider, 1964)。在蛾类飞行中，Böhm氏鬃毛能够调控触角姿态使其保持在合适的位置上，当切除此类感器后会导致蛾类在飞行中触角与翅的碰撞(Krishnanetal., 2012)。

我们采用顶空动态收集法和GC-MS技术从沙葱中鉴定出32种挥发性化合物，其中含硫化合物共有9种，占总量的49.3%(表1)。乌仁张嘎(2011)采用水蒸气蒸馏法提取、乙醚萃取沙葱中的挥发油, 利用 GC -MS从沙葱挥发油中共鉴定出37 种化合物，多为含硫化合物，与本研究结果一致。刘世巍等(2007)采用水蒸气蒸馏法提取、乙醚萃取沙葱中的挥发油, 利用GC -MS分析其化学成分，共鉴定出15种组分，主要为酯类、醛类、酸类、酮类及烷烃化合物。与本研究结果完全不同，这可能是由于沙葱生长地及挥发物收集方法的不同所造成的。

EAG测试结果表明，二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫、顺-2-己烯-1-醇、2-己烯醛、苯甲酸甲酯和己醛6种化合物能引起沙葱萤叶甲雌成虫较为强烈的触角电位反应，二烯丙基二硫和2-己烯醛能引起沙葱萤叶甲雄成虫较为强烈的触角电位反应(图2)，说明这些化合物可能在成虫定位寄主植物过程中发挥作用。其中二烯丙基硫醚和二烯丙基二硫属于硫化物，具有强烈的刺激性气味，是葱、蒜等百合科葱属植物的标志性成分(何洪巨等, 2004; Chengetal., 2014; Lietal., 2015)。同时，二烯丙基二硫(别名大蒜素)也是沙葱挥发物中含量最高的组分，这一结果与沙葱萤叶甲只取食沙葱、多根葱、野韭等百合科葱属植物相一致(昊翔等, 2014)。此外，除二甲基二硫醚和对二甲苯外，雌成虫对其他化合物的EAG值均高于雄成虫(图2)，这种现象在其他昆虫中也常有出现。同种昆虫由于性别和生理状态的差异，植物挥发物组分在其行为反应中所起的作用不同，因而对植物挥发物各组分的敏感性也不同(李祥等, 2021)。美国白蛾Hyphantriacunea雌、雄蛾对寄主植物挥发物的触角电位反应不同。斑鞘豆叶甲Colposcelissignata雌、雄成虫对不同挥发物的EAG反应也存在显著差异(樊瑞冬等, 2021)。我们前期对沙葱萤叶甲嗅觉相关基因表达谱的研究表明，多数气味结合蛋白基因OBP和化学感受蛋白基因CSP在雌虫触角中的表达量显著高于雄虫，说明雌性具有较为灵敏的嗅觉系统(Lietal., 2017, 2018)。 另外，当化合物浓度在0.1 mol/L时2-己烯醛和浓度为1 mol/L时测试的另外5种化合物均能激发沙葱萤叶甲成虫产生最强的触角电位反应(图3)，说明在这个浓度范围内，沙葱萤叶甲对化合物的电生理反应较为敏感。

触角电位技术能够记录昆虫整根触角上全部嗅觉感器的总电位反应。沙葱的6种化合物能够引起沙葱萤叶甲成虫较为强烈的触角电位反应，而本研究中观察到的沙葱萤叶甲成虫触角感器包括了毛形感器和锥形感器两类嗅觉感器，其中毛形感器有3种，锥形感器有2种，且毛形感器的数量较多，分布最广(图1)，推测毛形感器和锥形感器在沙葱萤叶甲识别寄主挥发物的过程中发挥了重要作用。Pophof等(2005)通过单感器记录技术表明仙人掌螟Cactoblastiscactorum触角上的毛形感器对信息素相关化合物很敏感。桉树天牛Phoracanthasemipunctata触角上的锥形感器对植物挥发物有特异反应(Lopesetal., 2002)。沙葱萤叶甲触角单个感受器的具体功能需通过触角单感器记录系统进行进一步研究。

综上所述，本研究首次对沙葱萤叶甲成虫触角感器的类型和分布特点进行了观察，并根据前人对其他昆虫触角感器的研究推测了沙葱萤叶甲触角各类感器的功能；采用顶空动态收集法和GC-MS分析了沙葱萤叶甲的最适寄主植物沙葱的挥发物成分，并通过EAG试验测试了沙葱萤叶甲成虫对沙葱主要挥发物的电生理反应。今后，还需利用透射电镜观察该虫触角感器的超微结构，利用单细胞电位记录等方法确定各类感器的功能，为深入研究沙葱萤叶甲的化学感受机制奠定一定基础。还需结合行为及田间试验对能够引起沙葱萤叶甲触角电位反应的活性物质进行进一步验证和筛选，以期开发出安全、高效的植物源引诱剂。