昆虫气味受体的研究方法与进展

白鹏华, 王 冰, 张仙红, 王桂荣

(1. 中国农业科学院植物保护研究所, 植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京100193;2. 天津市农业科学院植物保护研究所, 天津300384; 3. 山西农业大学植物保护学院, 山西太谷 030801)

昆虫灵敏的嗅觉系统用以识别环境中的气味化合物(例如植物挥发物和昆虫性信息素)，从而指导昆虫定位寄主、取食、交配、产卵和逃避伤害等重要生命活动(Zhang RBetal., 2017; Turlings and Erb, 2018; Guo and Wang, 2019; 王冰等, 2021; 游银伟和张龙, 2021)。昆虫识别气味化合物是一个复杂的过程，气味受体(odorant receptors, ORs)在昆虫触角外周嗅觉系统识别气味分子的过程中起着关键作用。气味分子激活ORs后，将化学信号转变为电信号，在嗅觉中枢触角叶内进行编码整合，进一步传递到更高级的中枢神经系统，使昆虫产生相应的嗅觉行为反应(Montagnéetal., 2015; Fleischeretal., 2018; 刘伟和王桂荣, 2020)。因此，昆虫气味受体功能的鉴定有助于揭示昆虫触角外周神经系统的嗅觉识别机制(de Fouchieretal., 2017; Fleischeretal., 2018; Bastin-Hélineetal., 2019)。

昆虫气味受体从结构上可分为2类：一类是在不同昆虫间高度保守且广泛表达的气味受体共受体(odorant receptor co-receptor, Orco)；另一类是普通气味受体(ORs)，这类受体在同一物种或不同物种间同源性很低且数量众多，与Orco共同作用形成复合二聚体，共同感受外界的气味分子。在鳞翅目中，气味受体又根据功能划分为性信息素受体(pheromone receptors, PRs)和普通气味受体，前者主要识别鳞翅目性信息素组分，后者大多识别植物挥发物等(Breeretal., 2019)。

随着组学技术的发展，越来越多的昆虫OR基因被鉴定出来，OR功能的研究方法也不断深入与发展起来。常用的ORs功能研究涉及到体外和体内两种方法(Montagnéetal., 2015)，前者包括爪蟾卵母细胞(Xenopusoocytes)异源表达系统结合双电极电压钳技术(two-electrode voltage clamp, TEVC)、转基因果蝇异源表达系统结合单感器记录技术(single sensillum recording, SSR)和细胞系异源表达系统结合钙离子成像技术(calcium imaging)；后者主要有RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)和CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated nuclease Cas9)基因编辑技术。深入了解各个研究方法的原理、实施的技术特点和应用范围，有助于开展行之有效的受体功能鉴定。因此，研究者可以根据研究的目的和现有的技术条件而选择不同的气味受体研究方法(Linetal., 2015; Wang Betal., 2016, 2018; Houetal., 2020)。本文主要从基因鉴定、表达定位和生理功能等方面对昆虫气味受体的研究进展进行了概述，归纳总结了2015年来昆虫气味受体研究的理论和技术发展，比较了不同研究方法的原理、特点和优缺点，为选择合适的气味受体功能研究方法提供参考。

1 气味受体基因的鉴定

气味受体基因的鉴定是开展气味受体功能研究的第一步。1991年，第一个气味受体基因在脊椎动物褐家鼠Ratfmnorvegicus嗅觉上皮组织中发现(Buck and Axel, 1991)。但是由于不同物种中气味受体基因的同源性较低，无法通过同源比对的方法获得昆虫气味受体基因。直到 1999 年，利用黑腹果蝇Drosophilamelanogaster全基因组测序的方法首次鉴定到昆虫第一个气味受体基因(Clyneetal., 1999; Robertsonetal., 2003)。随着组学技术的飞速发展，科学家们利用基因组、转录组、蛋白质组测序结合生物信息学分析等技术手段快速、准确地鉴定了多种昆虫气味受体基因 (Montagnéetal., 2015; Breeretal., 2019)。

1.1 基因组测序鉴定气味受体基因

昆虫嗅觉基因的鉴定得益于基因组测序技术的巨大进步和生物信息学的逐渐普及。基因组测序技术已由第一代发展至第三代。第一代DNA测序技术(例如 Sanger 测序技术)以链终止法或链降解法为原理，具有准确率高、读长较长等特点(Venteretal., 2001; 尹传林等, 2017)，利用该方法测定了一系列模式生物的基因组序列，例如果蝇、线虫等。但一代测序技术对于基因组较大的物种而言，其测序成本高、耗时长且通量低，无法实现大规模基因组测序。为降低测序成本，第二代测序技术(SOLi D 技术、Illumina Solexa技术和 454 技术)应运而生。Solexa 技术和454技术是基于边合成边测序的原理，而 SOLi D 技术是基于边连接边测序和双色法的原理。该技术克服了第一代测序技术的缺点，极大地降低了测序成本，提高了测序通量和测序速度，同时保持了高准确性，目前已基本代替了第一代测序技术(Shendureetal., 2017)。但由于其依赖于PCR扩增，易造成拷贝错误、信息丟失等缺点，且读长较短(最多只有200多bp)，导致基因组组装困难。在此基础上，第三代测序技术(纳米孔单分子测序技术)横空出世，其主要技术特点是DNA片段不需要扩增，而是以单分子为单位进行测序，显著提高了读长，已用于多倍体基因组的测序和组装。但三代测序技术数据分析过程较为复杂，准确率仍有待提高。

基因组测序技术的飞速发展大幅度降低了测序成本，越来越多的昆虫基因组序列被公布。昆虫基因组学重大专项 “5000种昆虫基因组测序计划(i5k)” 提出在2020年前后完成5 000种节肢动物基因组的测序和分析工作。在i5k全球性计划基础之上，中国农业科学院深圳农业基因组研究所联合浙江大学、西南大学等单位在2018昆虫基因组与绿色防控大会上共同推出了 “TOP1000昆虫基因组计划”。自2015-2019年通过基因组测序方法从27种昆虫中共鉴定了2 543个OR基因，覆盖了昆虫8个目，主要集中在鳞翅目、双翅目、半翅目、鞘翅目、蜚蠊目、直翅目、膜翅目和蜻蜓目(表1)。其中，烟草天蛾Mauducasexta和草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda等8种鳞翅目昆虫中鉴定出569个OR基因，占OR基因总数的21.75%(表1; 图1)(Kanostetal., 2016; Liu Hetal., 2019)；6种双翅目昆虫中鉴定出319个OR基因；5种半翅目昆虫中鉴定出437个OR基因；3种鞘翅目昆虫中鉴定出664个OR基因。

图1 2015-2019年利用基因组和转录组测序鉴定昆虫气味受体基因的数量

表1 2015-2019年利用基因组测序鉴定的昆虫气味受体基因

1.2 转录组测序鉴定气味受体基因

转录组测序技术具有成本低、测序效率高和时空表达等特点，可以分析昆虫不同发育阶段、不同组织和性别等样品的差异表达基因。该技术可用于非模式昆虫或基因组信息未知的昆虫气味受体基因鉴定。触角是昆虫嗅觉系统的重要组成部分，大量OR基因是根据触角转录组数据鉴定出来的，如大灰优蚜蝇Eupeodescorollae、黏虫Mythimnaseparata、桃小食心虫Carposinasasakii、黑肩绿盲蝽Cyrtorhinuslividipennis、稻水象甲Lissorhoptrusoryzophilus(Wang Betal., 2017; Duetal., 2018a; Tianetal., 2018; Wang GYetal., 2018; Zhang XXetal., 2019)(表2)。

表2 2015-2019年利用转录组测序鉴定的昆虫气味受体基因

续表2 Table 2 continued

续表2 Table 2 continued

此外，OR基因在一些昆虫的非嗅觉组织如喙、下颚须、足和生殖器甚至翅等中均有表达，这些基因在识别气味化合物中也发挥着重要作用(Xiaetal., 2015; Maetal., 2016; Guoetal., 2018)。

据不完全统计，2015-2019年，通过转录组测序技术从89种昆虫中共鉴定了5 111个OR基因(图1; 表2)。其中鳞翅目昆虫中鉴定的OR基因数量达1 898个，分布在36种昆虫，主要为棉铃虫Helicoverpaarmigera及其近缘种、小菜蛾Plutellaxylostella、桃小食心虫Carposinasasakii和苹果蠹蛾Cydiapomonella等重要农业害虫；其他目昆虫依次是鞘翅目(19种, 897个OR基因)、膜翅目(13种, 1 118个OR基因)、半翅目(9种, 406个OR基因)、双翅目(7种, 306个OR基因)和直翅目(5种, 486个OR基因)(图1; 表2)。OR基因数量在不同昆虫种类间差异很大，如松褐天牛肿腿蜂Sclerodermussp.的触角中仅有8个OR基因，而班氏跳小锋Aenasiusbambawalei的触角中多达226个OR基因(表2)。OR基因数目在不同物种间的显著差异性，说明了昆虫嗅觉识别能力的复杂性与不同基因的重要功能密切相关，这可能与其生存的生态环境和承受的自然选择压力不同有关(Leal, 2013; 何艳艳等, 2019)。

尽管转录组测序技术已广泛应用于OR基因鉴定，但转录组测序的精确度尚未达到基因组测序技术水平，很多低表达的基因和长度较长的基因很难鉴定出来。如基于基因组测序数据在棉铃虫H.armigera体内鉴定出87个OR基因，而基于转录组测序数据仅挖掘出60个OR基因(Zhang Jetal., 2015; Liu Hetal., 2019)。因此，未来仍需要基因组与转录组测序技术相结合，并利用多种生物信息学手段深入全面分析基因数据，寻找出更多的未知气味受体基因。

2 气味受体结构特征

在昆虫气味受体基因鉴定的基础之上，科学家们深入研究了昆虫气味受体蛋白结构，阐明ORs结构和生理功能之间的关系。Benton等(2006)首次揭示了昆虫气味受体的二级结构，其典型结构是7次跨膜蛋白，N端位于细胞质膜内，C端位于胞膜外。在胞内(intracellular, IC)和胞外(extracellular, EC)各形成3个Loop 环，其中胞外环1(extracellular loop 1, ECL1)通常由15～24个氨基酸组成，胞外环2(ECL2)由20～35个氨基酸组成，胞外环3(ECL3)最多由17个氨基酸组成；组成胞内环1(intracellular loop 1, ICL1)的氨基酸数量一般少于20，胞内环2(ICL2)由15～21个氨基酸组成，胞内环3(ICL3)氨基酸序列由16～180个氨基酸组成(Tiwarietal., 2019)。ORs的Loop环、C端和N端氨基酸序列的长度与其功能特异性是密切相关的(Palczewskietal., 2000)，其中具有较大胞外结构的胞外环2可能是昆虫识别外界气味分子的结合位点(Jacquin-Joly and Merlin, 2004)。黑腹果蝇D.melanogasterOR43a通过保守的C末端与共受体OR83b结合形成蛋白复合物，OR43a 和OR83b的ICL3 之间存在物理互作现象，成功确定了OR和Orco互作关系(Bentonetal., 2006)。随着生物信息学的快速发展，利用生物信息学工具能够快速预测昆虫气味受体蛋白二级结构。Liu YP等(2018)通过TMHMM 2.0 (https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)网站预测了小菜蛾P.xylostella的性信息素受体PxylOR8, PxylOR41和 PxylOR45 具有7个跨膜结构域，且具有细胞内N末端和细胞外C末端的拓扑结构；向候君等(2018)利用SOPMA软件(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析出斑翅果蝇DrosophilasuzukiiOrco二级结构中α螺旋占比为50.21%，直链延伸占比为20.16%，β转角占比为8.64%，无规则卷曲占比为20.99%。

在二级结构的基础上，三维结构的解析更有助于揭示气味受体的结构与其生理功能之间的关系。解析蛋白质三维结构的主要研究方法有X射线晶体学技术、核磁共振技术和冷冻电镜技术。由于X射线晶体学和核磁共振技术适用于水溶性蛋白结构解析，因此多种昆虫OBPs 的三维结构大多是利用以上两种方法完成的(张玉等, 2019; 杜亚丽等, 2020)。但这两种技术不适用大分子蛋白结构解析，因此无法实现膜蛋白ORs的三维结构研究。冷冻电镜技术(cryo-electron microscopy, Cryo-EM)的快速发展为揭示大分子蛋白生物结构与功能互作机制提供了技术支撑。该技术与X射线晶体学技术和核磁共振技术相比，在样品处理方面有着极大的优势，无需将大分子样品制成晶体，只需在低温下通过透射电子显微镜即可获得生物大分子的近 “原子级” 的分辨率成像，经过图像处理和重构计算，模拟出生物大分子的三维结构。冷冻电镜技术已成功应用于昆虫气味受体结构研究，Butterwick等(2018)利用该技术首次揭示了分辨率为3.5Å的寄生性榕小蜂ApocryptabakeriOrco晶体结构，del Mármol等(2021)利用该技术解析了原始昆虫石蛃Machilishrabei的MhraOR5晶体结构。Butterwick等(2018)和del Mármol等(2021)发现昆虫气味受体的4个蛋白质亚基组成了选择性离子通道，4个亚基松散地结合在通道的中心孔上，就像一朵花瓣。离子通道由1个胞外离子通道入口和4个胞内离子通道出口组成，离子通道最窄处的S7b 上的疏水氨基酸V469和L473是调控离子通道选择性的关键氨基酸位点(Butterwicketal., 2018)。该离子通道在气味配体刺激后出现胞外Ca2+内流和阳离子非选择性的离子电导，进一步说明了气味分子激发的气味受体信号转导是通过开放的离子通道实现的(Satoetal., 2008)。Butterwick等(2018)发现寄生性榕小蜂A.bakeriOrco的其中一个亚基的第1-6部分跨膜结构在胞外形成配体结合口袋(ligand-binding pocket)，也称“受体口袋”。del Mármol等(2021)利用冷冻电镜技术揭示了石蛃M.hrabei的MhraOR5与其配体丁香酚和驱虫剂避蚊胺的结合机制，研究发现将受体口袋上的蛋氨酸Met209突变为更小的疏水氨基酸时(缬氨酸或丙氨酸)，扩大了受体口袋，从而增加了受体对较大分子避蚊胺的亲和力，而降低了对较小分子丁香酚的亲和力。这可能是因为丁香酚结构较小，无法很好契合较大的受体口袋。del Mármol等(2021)揭示了昆虫气味受体蛋白口袋的单个氨基酸的突变就足以改变其结合特性，进而影响受体与化合物的相互作用，有助于揭示昆虫气味受体基因家族的分子演变，为进一步阐明气味识别机制提供了重要依据。

3 气味受体的表达和定位

基因表达和蛋白定位等信息有助于推测气味受体的特异性功能，为后续功能研究提供理论基础。目前主要利用半定量反转录PCR(semi-quantitative reverse transcription PCR, RT-PCR)、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)、原位杂交(insituhybridization)和免疫组织化学(immunohistochemistry)等生物化学、分子生物学技术手段分析OR基因的时空表达和ORs定位。

荧光原位杂交用于分析气味受体RNA水平的组织定位，Hou等(2020)利用此方法发现半紫毛顶蛾Eriocraniasemipurpurella的气味受体EsemOR3, EsemOR4和EsemOR5主要定位在识别性信息素的耳形感器内部，因此推测这些受体可能参与了性信息素识别过程。此外，不同荧光染料标记多种蛋白可以用来分析ORs之间或ORs与其他嗅觉蛋白之间的互作关系。Forstner等(2009)使用地高辛和生物素对多音天蚕Antheraeapolyphemus的ApolOR1和PBP基因分别进行荧光标记，结果表明ApolOR1和3个PBP基因均能在一种毛形感器中共表达，说明了PBPs与淋巴液中性信息素特异性结合并将其运送至ApolOR1，进而引发嗅觉反应。Yang K等(2017)通过双色原位杂交实验，发现烟青虫H.assulta触角上C类型毛形感器内不同的神经元内可以共表达性信息素受体基因HassOR14b和HassOR6或者HassOR14和HassOR16，揭示了不同功能的PRs在同一类型毛形感器内组合表达的分子机制；Pregitzer等(2019)报道沙漠蝗Schistocercagregaria的33个OR基因能够与性信息素识别相关的感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane protein, SNMP)基因SNMP1 共表达，初步推测这些OR基因可能参与了沙漠蝗的性信息素识别过程。

免疫组织化学用于分析气味受体蛋白水平上的组织定位，可以更为直观地观察气味受体蛋白的组织分布情况。Benton等(2006)利用免疫组织化学方法证明了黑腹果蝇D.melanogasterOrco(OR83b)与OR43a互作形成复合体并在神经元树突上准确定位并维持其稳定性。Auer等(2020)利用CRISPR/Cas9技术敲除果蝇DrosophilasechelliaOR22a后，通过免疫组织化学方法证明了OR22a在突变体触角部位不能成功表达和定位，为进一步阐明OR22a嗅觉功能提供了有利证据。与荧光原位杂交相比，免疫组织化学需要制备气味受体的特异性抗体，而膜蛋白抗体制备相对复杂，因此气味受体定位研究仍以原位杂交方法为主。

半定量RT-PCR和qRT-PCR常用于研究OR基因在不同组织、发育阶段和性别中的表达模式。半定量RT-PCR方法相对简捷，主要根据电泳条带的明暗程度反映OR基因的表达量，但该方法无法量化。实时荧光定量PCR将基因表达量数值化，准确度高于半定量检测方法。至今为止，通过半定量RT-PCR和qRT-PCR方法解析了多数昆虫气味受体的表达谱，为后续功能特异性研究提供理论依据。大部分OR基因在成虫期的触角中高表达，少数在幼虫期表达，如棉铃虫H.armigera、中国梨咯木虱C.chinensis和梨小食心虫G.molesta(Dietal., 2017; Xuetal., 2019; Chenetal., 2020)。研究显示，鳞翅目昆虫雄虫通过触角上灵敏的嗅觉系统识别同种雌虫释放的特异性信息素来寻找合适的配偶，因此参与性信息素识别的PRs一般特异性地表达于雄虫触角(Fleischeretal., 2018; Liu YPetal., 2018; Bastin-Hélineetal., 2019; Liu XLetal., 2019)。OR基因除了在触角内高表达或特异性表达外，也有少部分OR基因在喙、产卵器和足等其他组织中表达(Chooetal., 2018; Duetal., 2018a; Guoetal., 2018)。如烟青虫H.assulta气味受体基因HassOR31在产卵器中表达量显著高于触角和其他组织中的表达量，经体外功能验证表明该气味受体可以帮助雌虫精确选择寄主植物作为产卵地点(Li RTetal., 2020)。

综上所述，OR基因表达特异性与其生理功能密切相关，分析OR基因在不同组织、不同性别、不同发育阶段的表达特性以及ORs在昆虫组织中的定位情况，将为功能基因筛选提供理论依据。

4 气味受体的功能研究方法

随着生物技术的快速发展，关于ORs功能研究的方法逐渐多样化，主要分为体内和体外研究方法。常用的体外功能研究方法为爪蟾卵母细胞表达系统结合双电极电压钳技术(TEVC)，利用转基因果蝇异源表达系统结合单感器记录技术，以及细胞系异源表达系统结合钙离子成像技术。体内功能研究方法有RNA干扰(RNAi)技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术。本文查阅了2015-2019年昆虫气味受体功能鉴定的文献，统计了利用不同研究方法鉴定ORs功能的文章数量(图2)。统计结果表明：体外功能研究方法在5年内ORs功能研究中占比75.76%，其中爪蟾卵母细胞表达系统结合双电极电压钳技术占比43.94%，其次是转基因果蝇异源表达系统结合单感器记录技术占比19.70%，再次是HEK293细胞系异源表达系统(占10.61%)，该数据说明了爪蟾卵母细胞表达系统结合双电极电压钳技术在ORs功能研究中具有普遍适用性；体内表达方法以CRISPR/Cas9基因编辑技术(12.12%)和RNAi技术(12.12%)为主。不同研究方法的作用机理和方法特点各不相同，下面将从功能研究方法的使用特点、应用范围和影响因素进行详尽的阐述，为ORs功能研究方法的选择提供一定的借鉴作用。

图2 2015-2019年昆虫气味受体功能鉴定方法发文统计

4.1 气味受体的体外功能研究方法

4.1.1爪蟾卵母细胞表达系统结合双电极电压钳技术：第一个完成功能鉴定的昆虫气味受体是黑腹果蝇D.melanogasterDmelOR43a，通过爪蟾卵母细胞表达结合双电极电压钳技术证实了DmelOR43a能够识别果实中常见的气味分子环己酮、环己醇、苯甲醛和苯甲醇(Wetzeletal., 2001)。该系统是将体外合成的OR和Orco的cRNA共同注射到爪蟾卵母细胞中，体外培养3～5 d，将气味配体灌流通过爪蟾卵母细胞对其进行刺激，利用双电极电压钳技术记录刺激前后的电流差，从而确定气味受体与配体之间的功能。随着该技术不断地完善和改进，目前已成为昆虫气味受体功能研究中最常用的体外研究方法。据不完全统计，2015-2019年利用该技术对ORs功能的研究占所有研究方法的43.94%，该技术在2019年ORs研究中占比高达61.90%，且主要应用于鳞翅目昆虫气味受体功能研究(图2)。在爪蟾卵母细胞表达系统中，双委夜蛾A.dissimilis气味受体AdisOR1对性信息素(顺)-9-十四碳烯醇[(Z)-9-tetradecenol]和(顺)-9-(反)-12-十四碳烯二烯醇[(Z)-9-(E)-12-tetradecadienol] 具有强烈的电生理反应(Liu XLetal., 2019)；二点委夜蛾A.lepigone性信息素受体OR3特异识别性信息素(顺)-7-十二碳烯乙酸酯[(Z)-7-dodecenyl acetate] (Zhang YNetal., 2019)；苹果蠹蛾C.pomonella气味受体CpomOR2a和CpomOR5均能被其次要性信息素组分(反)-8-(反)-10-十二碳二烯醇乙酸酯 [(E,E)-8, 10-dodecadien-1-yl acetate] 所激活(Tianetal., 2021)。该系统也适用于鳞翅目昆虫普通气味受体的配体筛选，如Wu H等(2019)借助该系统发现烟青虫H.assulta气味受体HassOR23特异性识别植物挥发物(反)-β-法尼烯[(E)-β-farnesene]而躲避天敌；Wang等(2020)通过该系统证明了烟青虫H.assulta气味受体HassOR67能够识别烟草Nicotianatabacum挥发物壬醛(nonanal)进而引诱雌成虫产卵；Guo等(2021)利用爪蟾卵母细胞表达系统全面测定了棉铃虫H.armigera44个气味受体对67种寄主植物挥发物的反应，鉴定了28个气味受体的配体，绘制了棉铃虫气味受体家族编码寄主植物挥发物的功能图谱，揭示了棉铃虫气味受体通过组合编码的方式识别复杂的寄主挥发物。爪蟾卵母细胞表达系统不仅广泛应用于鳞翅目昆虫气味受体功能研究，在其他目昆虫中也有报道(Zhang RBetal., 2017; Zhang RBetal., 2019; Liu YPetal., 2020; Zhangetal., 2021)。Li HM等(2020)利用该系统检测了大灰优蚜蝇E.corollae气味受体EcorOR25能够特异性识别14种芳香族化合物，如丁香酚(eugenol)和甲基丁香酚(methyl eugenol)等，表明EcorOR25可能是大灰优蚜蝇识别芳香族化合物的主要受体；Liu YP等(2020)的研究揭示了柑橘大实蝇B.minax气味受体BminOR24能够识别常见植物挥发物芳樟醇(linalool)，说明BminOR24可能参与了寄主识别等生命过程；Zhang等(2021)利用双电极电压钳技术对3种盲蝽象性信息素受体功能进行研究，结果表明绿盲蝽A.lucorum性信息素受体AlucOR2/51、苜蓿盲蝽A.lineolatusAlinOR4/6 和中黑盲蝽AdelphocorissuturalisAsutOR6均能够识别性信息素组分(反)-2-己烯基丁酸酯[(E)-2-hexenyl butyrate]，而对另一个组分丁酸己酯(hexyl butyrate)反应较弱，阐明了不同种盲蝽象性信息素受体对性信息素识别的分子机制。

爪蟾卵母细胞表达系统结合双电极电压钳技术之所以成为目前应用最广的体外功能研究方法，得益于其细胞个体大、易培养、操作简单、结果稳定等优点，且注射气味受体cRNA后能在短时间内表达并实现功能记录(Wang Betal., 2016)，适用于气味配体的快速筛选(Guoetal., 2021)。

4.1.2转基因果蝇异源表达系统结合单感器记录技术:转基因果蝇异源表达系统是继爪蟾卵母细胞表达系统之后的第二大类体外功能研究方法，在2015-2019年ORs功能研究中占比19.70%(图2)。该系统主要有两个突变体系统，即果蝇“empty neuron”空神经元系统和 “OR67dGAL4knock-in” 突变系统。Dobritsa等(2003)建立了果蝇 “empty neuron” 空神经元系统，该系统敲除果蝇锥形感器内嗅觉受体神经元ab3A上表达的气味受体基因OR22a和OR22b，从而获得果蝇空神经元 “△halo” 突变体，利用GAL4/UAS系统以OR22a的启动子驱动Gal4的表达，进一步使UAS驱动下游异源OR基因在 “△halo” 空神经元中表达，再利用单感器记录技术记录锥形感器ab3A神经元对气味配体的反应。de Fouchier等(2017)利用该系统成功解析了海灰翅夜蛾S.littoralis气味受体 SlitOR35, SlitOR4, SlitOR14, SlitOR17和SlitOR31的功能。

果蝇锥形感器 “空神经元” 系统可用于大多数昆虫气味受体的功能鉴定，但不适用于毛形感器中表达的法尼醇受体(DmelOR83c)和鳞翅目性信息素受体的功能鉴定(Syedetal., 2006; Montagnéetal., 2012; Ronderosetal., 2014; Wang Betal., 2016, 2018)。研究发现在缺失昆虫感觉神经元膜蛋白SNMP1 的突变果蝇品系中，表达性信息素受体 DmelOR67d 的神经元无法识别果蝇性信息素(顺)-十八碳烯醇醋酸盐(cis-vaccenyl acetate, cVA)，但转入SNMP1 基因后对cVA的反应恢复正常，这说明 SNMP1 对果蝇感受性信息素是必不可少的(Bentonetal., 2007)。不仅如此，SNMP1 对于鳞翅目昆虫毛形感器中表达的PRs感受性信息素配体也是必需的(Syedetal., 2010; Breeretal., 2019; Lemkeetal., 2020; Liu Setal., 2020)。为此，研究人员开发了另一种果蝇突变系统，即 “OR67dGAL4knock-in” 突变系统(Kurtovicetal., 2007)。该系统利用GAL4/UAS将目的OR基因表达在果蝇at1毛形感器空神经元中，再结合SSR技术记录表达异源受体的神经元的功能(Kurtovicetal., 2007)。“OR67dGAL4knock-in” 突变系统已广泛应用于鳞翅目昆虫PRs的配体筛选和功能研究。如苹果蠹蛾C.pomonella受体CpomOR6a在转基因果蝇毛形感器at1神经元中表达时能够灵敏地识别性信息素拮抗剂(反)-8-(反)-10-十二碳二烯-1-醇乙酸酯[(E,E)-8,10-dodecadien-1-yl acetate] (Cattaneoetal., 2017)；Wang B等(2018)利用该系统异源表达烟青虫H.assulta、棉铃虫H.armigera和烟芽夜蛾Heliothisvirescens3个近缘种的性信息素受体OR13，结果显示3种昆虫的OR13均能够特异性识别性信息素成分(顺)-11-十六碳烯醛(cis-11-hexadecenal)。

转基因果蝇技术为OR基因异源表达提供了触角感器淋巴液等生理环境以及蛋白组件。该方法采用单感器记录技术使得待测气味分子以气体形式进入至感器内部，更符合真实的细胞环境。然而该系统也存在一定的缺点，例如获得转基因果蝇品系过程复杂且耗时长，操作复杂、且难度较大(Wang Betal., 2016)。

Wang B等(2016, 2018)比较了爪蟾卵母细胞表达系统与转基因果蝇异源表达系统在ORs功能研究上的适应性，结果表明两个研究方法得到的结果是一致的，说明了这两个系统均适用于气味受体功能研究。因此，在进行ORs功能鉴定时，可以先采用爪蟾卵母细胞表达系统在体外快速筛选气味受体对应的配体，再结合转基因果蝇异源表达系统进一步精确地鉴定气味受体的功能，实现双系统快速且准确鉴定ORs与配体之间的一一对应关系。使用不同表达系统鉴定ORs功能对溶剂选择也有一定的要求，例如溶剂正己烷挥发性强，更适合于转基因果蝇系统中对特定化合物激活的受体功能检测；而石蜡油具有重复性好的特点，适合高通量筛选化合物；二甲基亚砜溶解性较好，是爪蟾卵母细胞系统的较为理想的溶剂。

4.1.3细胞系异源表达结合电生理技术:细胞系异源表达系统结合钙离子成像方法也成功应用于昆虫气味受体的功能研究。该技术原理是将构建好的OR和Orco的基因表达载体转染到细胞系并启动瞬时表达，利用膜片钳或者钙离子成像技术检测气味受体对配体的反应。常用细胞系主要包括人类胚肾细胞系(HEK293细胞系)和草地贪夜蛾S.frugiperda卵巢细胞系(Sf9细胞系)等。HEK293细胞系在异源细胞系表达中应用最为广泛，目前已在苹果蠹蛾C.pomonella、红醋栗穿孔蛾Lamproniacapitella和半紫毛顶蛾E.semipurpurella等昆虫中成功应用(Cattaneoetal., 2017; Yuvarajetal., 2018; Houetal., 2020)。除了常用的HEK293细胞系，Xu 等(2015)通过Sf9细胞系异源表达系统明确烟青虫H.assulta性信息素受体HassOR13能够特异性识别性信息素成分(顺)-11-十六碳烯醛[(Z)-11-hexadecenal]。但有报道表明，Sf9细胞系异源表达OR基因系统中具有功能反应的细胞比例较低(Corcoranetal., 2014)。

体外功能研究方法简便易行，但是缺乏体内真实的细胞生理条件及细胞表达的上游环境(Miazzietal., 2019a, 2019b)。因此，研究人员通过在反应体系中添加相应的PBP，提高了性信息素受体对性信息素的敏感性和选择性(Grosse-Wildeetal., 2006; Sunetal., 2013; Changetal., 2015; Zhang QHetal., 2017)。近期，Hou等(2020)系统地比较了两种体外功能研究方法，结果表明借助爪蟾卵母细胞表达系统异源表达半紫毛顶蛾E.semipurpurellaEsemOR4能够特异性识别性信息素成分(顺)-6-壬烯-2-醇[(R,Z)-6-nonen-2-ol]，而HEK293细胞系表达系统则未能识别该配体，说明了爪蟾卵母细胞结合双电极电压钳技术更加能够准确地反映OR识别气味配体的功能。

4.2 气味受体体内功能研究方法

尽管体外功能研究能够记录ORs的功能反应特征，但ORs在昆虫体内的生理特性及其作用机理并不十分清楚。因此，体内功能研究方法应运而生，为真实、准确地研究气味受体功能提供了新途径。

4.2.1基因沉默技术：RNA干扰(RNA interference, RNAi)是基因沉默常用的技术手段。Fire等(1998)首次在秀丽隐杆线虫Caenorhabditiselegans中证明了双链 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)是基因沉默的有效方法。RNAi技术主要作用机制可分2步，1)切割外源dsRNA：dsRNA进入细胞后被细胞内的核酸内切酶Dicer剪切成小干扰RNA(siRNA)；2)目的基因沉默：siRNA解链后，反义链与RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)结合，再与目的基因mRNA 结合并将其降解，从而引起靶标基因功能沉默(Bernsteinetal., 2001)。

dsRNA通常以注射、饲喂、浸泡和涂抹等方法进入昆虫体内，其中注射方式最为常用且效果最好。RNAi技术发展早且相对成熟，具有简单、便捷的特点，在半翅目和膜翅目昆虫气味受体功能验证研究中得以广泛应用。Zhang RB等(2017)发现注射dsApisOR5后的豌豆蚜Acyrthosiphonpisum丧失了其对蚜虫报警信息素(反)-β-法尼烯[(E)-β-farnesene]的识别能力，说明ApisOR5在豌豆蚜识别报警信息素的过程中发挥着重要作用，为以该受体为靶标筛选高效稳定的蚜虫驱避剂奠定了理论基础；Wang YL等(2017)报道干扰荔枝蝽平腹小蜂AnastatusjaponicusAjapOR35基因后，其对具有产卵吸引效应的化学物质(反)-α-法尼烯[(E)-α-farnesene]和β-石竹烯(β-caryophyllene)的EAG 反应值下降，说明AjapOR35可能与其寄主定位和产卵行为密切相关。

RNAi技术也具有一定的局限性，例如在鞘翅目昆虫中基因沉默效率较高，但在鳞翅目昆虫中干扰效果不太理想(胡少茹等, 2019; 曹松等, 2020)，主要原因是dsRNA易被鳞翅目昆虫体内的核酸降解酶降解，致使RNAi效率较低(Shuklaetal., 2016; Guanetal., 2018)。其次，当外源合成的dsRNA/siRNA以饲喂、浸泡和涂抹等方法进入昆虫体内，需要穿透害虫肠道围食膜、细胞膜甚至体壁等屏障，进而降低沉默效率。再次，虽然传统的注射方式效果较好，但易对昆虫造成损伤且不易操作。RNAi技术的另一个缺陷是具有时效性，沉默效果会随着时间的推移慢慢消失，而且不能够稳定遗传(Linetal., 2015; Chenetal., 2020)。随着纳米科学的不断发展，纳米材料作为一种dsRNA递送载体，可以提高dsRNA穿透害虫体壁等屏障的能力，提升沉默效率。相较于传统的递送策略，纳米载体介导的RNAi递送系统具有高效、稳定、低剂量、缓释等优点(Yanetal., 2021)。因此，RNAi技术结合纳米载体有望快速实现RNAi农药商品化，为害虫防控提供了新思路。

4.2.2基因编辑技术：基因编辑是指利用核酸内切酶在基因组的特定位置产生位点特异性双链断裂，诱导细胞自身的 DNA 损伤修复机制对切口位置进行非同源末端连接或同源重组修复，从而产生基因插入、缺失等多种突变类型。基因编辑技术已从第一代的锌指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)技术发展到第二代转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like efector nucleases, TALENs)技术，再到第三代CRISPR/Cas系统[clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated proteins]。新兴起的CRISPR/Cas9 技术依靠单链向导RNA(single-guide RNA, sgRNA)对原间隔序列毗邻基序(protospacer adjacent motif, PAM)上游约20 nt的靶序列识别，再通过Cas9核酸酶进行切割，实现基因组定点编辑。

随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的不断完善，该技术已成功用于昆虫传统气味受体共受体(Orco)和鳞翅目昆虫性信息素受体(PRs)等的功能研究(图2)。Fandino等(2019)敲除烟草天蛾M.sexta气味受体共受体基因MsexOrco后，其对性信息素和寄主植物挥发物等气味的电生理反应显著降低，说明了MsexOrco在烟草天蛾嗅觉识别过程中的必要性；敲除印度跳蚁Harpegnathossaltator的Orco基因后，其工蚁对信息素的感受能力明显下降且突变体的触角叶体积和嗅小球的数量明显减少(Yanetal., 2017)。CRISPR/Cas9技术以其操作的便捷性，高效的基因编辑能力在鳞翅目昆虫气味受体功能研究中渐受青睐。Chang HT等(2017)利用CRISPR/Cas9技术敲除棉铃虫H.armigera性信息素受体基因HarmOR16后，突变体雄虫丧失了对(顺)-11-十六碳烯醇[cis-11-hexadecenol]的趋避行为反应，且不能区分雌虫是否性成熟，进而与未成熟的雌虫进行交配，导致后代存活率降低。该项研究结果揭示了HarmOR16受体参与调控棉铃虫H.armigera选择最优交配时间的分子机制。Garczynski等(2017)等通过该技术发现苹果蠹蛾C.pomonella性信息素受体基因CpomOR1-/-突变体雌虫的产卵量及卵孵化率均显著下降，证明了CpomOR1与其雌虫的生殖能力密切相关。Liu XL等(2020)利用 “体外(爪蟾卵母细胞表达系统)+体内(CRISPR/Cas9技术)” 双系统证实了PxylOR35和PxylOR49共同决定小菜蛾P.xylostella雌蛾的产卵选择性，揭示了小菜蛾雌虫利用植物挥发物定位寄主进行产卵的关键分子机制。Guo等(2021)发现鳞翅目中存在一个高度保守的直系同源基因(棉铃虫H.armigera气味受体基因HarmOR42及其同源基因)且形成独特的进化分支，并通过“体外(爪蟾卵母细胞表达系统)+体内(CRISPR/Cas9技术)” 双系统证明了棉铃虫气味受体HarmOR42能够特异识别被子植物花香的主要挥发物苯乙醛(phenylacetaldehyde)，说明该受体在鳞翅目昆虫寻找寄主植物特别是花的过程中发挥至关重要的作用。CRISPR/Cas9技术在其他目昆虫中也有报道，Guo等(2020)借助 “体外(爪蟾卵母细胞表达系统)+体内(CRISPR/Cas9技术)” 双系统证实了LmigOR35是东亚飞蝗L.migratoria群聚信息素4-乙烯基苯甲醚(4-vinylanisole)的特异性受体，继而对东亚飞蝗群居信息素功能进行了全面而充分的鉴定和验证。

与基因沉默技术相比，CRISPR/Cas9技术能够彻底沉默目的基因表达，因此结果更为准确且能稳定遗传。该技术可以实现同时剪切靶基因上多个靶标位点，设计更加灵活(Gaoetal., 2016)。但也具有一定局限性，例如基因编辑技术步骤较为复杂，需要通过多代筛选来获得纯合突变品系，操作过程对仪器平台以及操作人员熟练程度要求较高。同时，该系统存在一定的脱靶现象，但通过两个sgRNA靶标一个基因可以有效降低脱靶率(Kleinstiveretal., 2016; Zhang DBetal., 2017)。

5 小结与展望

昆虫嗅觉系统在昆虫行为选择过程中发挥着重要作用，其中气味受体是外周神经系统中接收嗅觉识别信号的关键蛋白，研究ORs的功能对于解析昆虫嗅觉编码机制十分重要。自21世纪始，关于昆虫ORs的研究论文层出不穷。Montagné等(2015)综述了2000-2014年(15年)期间昆虫ORs的研究进展以及研究技术的发展历程。在此基础上，本文针对2015年以来(近5年)有关昆虫OR研究工作的发文情况进行了统计分析，归纳总结了昆虫OR基因鉴定、表达定位、蛋白结构等的研究方法、原理和特点等。分析结果显示，2015-2019年利用基因组测序技术在27种昆虫中鉴定了2 543个OR基因，利用转录组测序技术从89种昆虫中鉴定了5 111个OR基因(表1; 表2)，为昆虫ORs结构和功能的研究奠定基础。随着结构生物学的发展，利用冷冻电镜技术实现了昆虫ORs蛋白结构的解析，为揭示大分子蛋白生物结构与功能互作机制提供了技术支撑。此外，本文重点综述了昆虫气味受体功能研究常用技术的原理和特点，分析了各自的优势和不足，列举了重要害虫ORs的研究进展，为ORs研究方法的选择提供一定的借鉴作用(Wang Betal., 2016, 2018; Caoetal., 2020; Houetal., 2020)。

尽管昆虫气味受体功能研究已经取得了重大进展，但是仍有以下几个方面需要深入研究：1)昆虫体内拥有大量气味受体基因，随着生物信息学的快速发展，应继续挖掘重大农林害虫的嗅觉基因，并且针对每一个特异性基因开展功能研究，全面系统揭示害虫识别寄主植物、交配和产卵以及躲避天敌等行为的分子机制。发展更加简便快捷、高灵敏度且重复性好的基因功能验证手段仍是未来一段时间内的主要目标。2)目前鳞翅目昆虫中的PRs功能研究取得了较大的进展，但其他目昆虫的ORs功能研究仍然较少。近年来，在害虫识别配偶和寄主植物的嗅觉分子机制进行了深入研究，而有关昆虫如何协同识别性信息素和寄主植物挥发物的分子机制尚未明确。此外，天敌昆虫与害虫之间的气味识别机制研究仍不够深入，挖掘天敌识别害虫的关键嗅觉基因，有助于筛选天敌昆虫行为调节剂，降低靶标害虫危害。3)气味受体功能研究正从基因水平转向蛋白结构层面，冷冻电镜技术的快速发展促进了昆虫气味受体三级结构的解析。气味受体蛋白晶体结构结合蛋白组学等方法有助于揭示气味分子与ORs的结合机制及其激活模式，从结构生物学角度深入探讨每一种昆虫如何演化出自己的独特受体，从而特异性识别寄主植物、配偶和天敌等化学线索。4)尽管我们针对气味受体功能基础研究取得了一些进展，但如何将这些理论成果应用于害虫防控更值得我们深入思考。RNAi技术在害虫防治领域已取得突破性进展，但由于dsRNA合成成本较高，少有成熟产品问世。随着合成生物学的飞速发展，通过改造工程菌有望实现低成本、大规模合成dsRNA，这一技术为开发新型昆虫行为调节剂提供了新视角。同时，基因编辑技术的发展为基于转基因昆虫进行害虫防治提供了新途径，通过敲除害虫关键靶标基因，干扰害虫交配和定位寄主，压低田间虫口数量，实现绿色防控。