白星花金龟对寄主植物挥发物的电生理反应

王光宇, 张萌萌, 陈 立

(河北大学生命科学学院, 生命科学与绿色发展研究院, 河北保定 071002)

白星花金龟Protaetiabrevitarsis属鞘翅目(Coleoptera)金龟科(Scarabaeidae)花金龟亚科(Cetoniinae)(Lewis, 1879)，国外主要分布于蒙古、韩国、朝鲜、日本、俄罗斯等国家，在我国主要分布于华北、东北、黄淮海及新疆等地区(刘广瑞等, 1997)。白星花金龟一年1代，以幼虫在土壤内越冬，成虫次年6-7月出土，对粮食、蔬菜、水果等众多经济作物危害严重，尤其喜食葡萄、苹果、柑橘、玉米等作物的果实且常为群集为害(陈日曌等, 2006; 龚建等, 2017)。在新疆，该虫导致的葡萄被害率在20%～40%之间，有时甚至达到60%，严重威胁到我国的农业生产(郭文超等, 2004; 李涛, 2018)。

白星花金龟的防治措施主要有3种：一是农业防治，如深耕漫灌；二是化学防治，在有机肥或土壤中撒施农药以防治白星花金龟的幼虫、蛹；三是基于白星花金龟成虫的假死性，采用人工震落并捕捉的机械防治方式(周智颖, 2020)。白星花金龟成虫常为害成熟果实，为保证产品的安全性，不宜采用化学农药进行防治，转而采用糖醋液诱集捕杀的方法(李仲秀等, 1995; 郝双红等, 2005)，但效果并不理想。因此，有必要开发环境友好、成本低廉的科学防治技术。

丽金龟科(Rutelidae)和花金龟科(Cetoniiae)金龟甲成虫常取食植物地上部分以获得补充营养，并在植物上进行求偶活动，其取食和交配等行为必然会受到植物挥发物的影响。健康植物主要释放组成型绿叶挥发物，但当受到昆虫取食为害时，会释放大量虫害诱导产生的植物挥发物(Hararietal., 1994; Loughrinetal., 1996)。金龟甲也能通过嗅觉感受植物挥发物及其成分变化(热孜宛古丽·阿卜杜克热木等, 2018)，并产生行为反应。健康欧洲山毛榉释放的绿叶挥发物能吸引花园金龟Phylloperthahorticola，雄虫还能利用取食诱导的植物挥发物来定位雌性配偶(Ruther, 2004)；日本丽金龟Popillajaponica取食为害诱导海棠叶产生大量萜烯类成分，能引诱日本丽金龟聚集(Loughrinetal., 1995)；被日本丽金龟和绿花金龟Cotinisnitida取食后的葡萄果实挥发物中醇类与酯类显著增加，可引诱更多的绿花金龟聚集取食(Hammonsetal., 2009)。

本研究旨在利用气相色谱-触角电位联用技术(gas chromatography-electroantennogram detection, GC-EAD)与气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)鉴定苹果、葡萄和玉米3种寄主果实在健康和受害两种状态下对白星花金龟雌成虫触角有电生理活性的挥发物成分及其含量，为开发用于防控白星花金龟的植物源诱剂打下基础。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

白星花金龟成虫采集于石河子大学农学院试验站内，在实验室内用苹果喂养，室内温度28℃，相对湿度60%。实验前区分雌、雄成虫，选择60日龄左右的健康雌虫用于受害果实处理及电生理实验。

1.2 寄主果实挥发物的采集

新鲜红富士苹果和巨峰葡萄从市场购买，幼嫩甜玉米穗采摘于北京市海淀区上庄镇玉米田。新鲜苹果、葡萄和玉米视为健康状态，20头白星花金龟成虫(雌虫∶雄虫=1∶1)取食24 h后的苹果、葡萄和玉米视为受害状态。将约400 g健康或受害果实放入PE保鲜袋[35 cm×45 cm，佳能(中国)有限公司]中。大气采样仪(QC-1S，北京市劳保所)的出气口用四氟乙烯软管与活性炭棒(20 g, 10～20目)相连接，空气经碳棒过滤后通入保鲜袋的一端，保鲜袋的开口处用棉绳扎紧。在保鲜袋的另一端插入一根装有Porapark Q吸附剂(200 mg, 80/100目，Sigma-Aldrich)的吸附管(内径5 mm)，用食品级硅胶软管连接吸附管和大气采样仪进气口。大气采样仪流速为500 mL/min，采样时间为2.5 h。将顶空收集完毕的吸附管用1 mL浓度为5 ng/μL的苯甲酸甲酯溶液(溶剂为色谱纯二氯甲烷)洗脱获得0.5 mL样品，保存至-20℃冰箱中。每个采样处理重复7次。所获得的样品直接用于GC-FID定量分析，然后将来自同一处理的样品合并、浓缩后进行GC-EAD和GC-MS分析。

1.3 定量分析

使用气相色谱(GC-2010 Plus, Shimadzu)对所获样品进行定量分析，气相色谱安装有DB-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm, Agilent Technologies)。采用无分流进样模式，进样量为2 μL，进样口温度为230℃，检测器温度为250℃，载气为氮气，流速为1 mL/min。升温程序为：初始温度40℃，保持2 min；以5℃/min的速率升至120℃；以15℃/min升至240℃，保持4 min，整个过程持续30 min。利用GC-Solution软件对各成分的相对峰面积进行积分，计算出相对含量，根据内标(苯甲酸甲酯)的浓度对各成分进行定量，用非参数检验对比同种果实活性成分不同状态下的含量差异， 7个重复。

1.4 GC-EAD分析

GC-EAD分析方法参照Chen等(2019)，将气相色谱与触角电位仪(Kirchzarten, Syntech)联用。触角电位仪由IDAC-2数据采集控制器、CS-55气流刺激控制装置和微动操纵器组成。气相色谱仪(GC-2010 Plus, Shimadzu)的毛细管柱型号与定量分析时相同，毛细管柱的末端连接Y型分流管(Agilent Technologies)，Y型分流管的两个分支分别连接内径0.25和0.32 mm的毛细管柱，细毛细管连接FID检测器，粗毛细管经过加热套连接到吹向触角连接的持续气流管。两根毛细管柱的长度比为2∶3，分流比约为1∶2。载气为氮气，流速为2 mL/min。同时在Y型分流管前端增加一路补充气体，流速为20 mL/min。进样模式、进样量、进样口温度、检测器温度与升温程序均与定量分析时一致。用微型手术刀将雌成虫触角切下，基部连接到参比电极，鳃瓣分开后将其中一个连接到记录电极。净化和加湿后的持续气流以400 mL/min的速率吹向触角。用GC-EAD软件记录触角的电生理信号和气相色谱的FID信号，每个样品重复记录8～10次。

1.5 化合物的鉴定

色谱柱与定量分析时相同，无分流模式，进样量为1 μL，载气为氦气，流速为1 mL/min，进样口温度为230℃，离子源温度为230℃，电离方式为EI，电离能量为70 eV，质量扫描范围为 40～500 amu。升温程序为：初始温度40℃，保持5 min；以5℃/min的速率升至240℃，保持5 min，整个过程持续50 min。GC-MS分析结果经与NIST14谱库对比及标准品验证，确定化合物的具体成分。

1.6 触角电生理活性成分的主成分分析及聚类分析

为描述果实种类及受害状态对挥发物的影响，对3种果实、两种不同受害状态下能够引起触角电位反应的成分进行主成分分析(principle component analysis, PCA)。每个处理7个重复，用Origin 2019b对数据进行标准化处理并利用相关性矩阵计算数据之间的特征向量。聚类分析(cluster analysis, CA)选择前2个主成分的欧式距离使用瓦尔德法对6个处理的挥发物进行分组，构建聚类谱系图，分析软件为SPSS 23.0。根据主成分分析结果及聚类谱系图绘制二维因子载荷图。

1.7 数据分析

利用SPSS 23.0对不同状态下果实挥发物中EAD活性成分含量(平均值±标准误, n=7)进行数据分析，显著性差异分析克鲁斯卡尔-沃利斯成对比较检验(Kruskal-Wallis test)(P<0.05)。利用Origin 2018对不同状态下的果实挥发物活性成分进行主成分分析；根据主成分分析结果，用SPSS 23.0对不同状态下的果实挥发物进行聚类分析。

2 结果

2.1 白星花金龟雌成虫对苹果挥发物的GC-EAD反应

苹果果实挥发物中共有23种物质能够明显引起白星花金龟雌成虫的触角电位反应，其中健康苹果中有18种，受害苹果中有21种(图1)。 两种状态下均能引起触角电位反应的物质有13种，分别为丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁酸丙酯、己酸甲酯、2-甲基丁醇、 己酸乙酯、 乙酸己酯、 6-甲基-5-庚烯-2-酮、己醇、壬醛、异戊酸己酯和α-法尼烯。健康状态下能够引起触角电位反应的特有挥发物成分有2种，分别为乙酸丁酯和己酸丙酯；受害状态下能够引起触角电位反应的特有挥发物成分有5种，分别为2-甲基丁酸甲酯、3-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯、3-甲基-3-丁烯-1-醇和辛酸乙酯。根据定量结果，有3种成分仅在浓度显著高于另一状态时才发生触角电位反应，如2-甲基丙醇、乙酸戊酯、丁酸丁酯(图1; 表1)。

图1 白星花金龟雌成虫对苹果挥发物的GC-EAD反应

2.2 白星花金龟雌成虫对葡萄挥发物的GC-EAD反应

葡萄果实中共有23种挥发物能引起白星花金龟雌成虫的触角电位反应，其中健康葡萄有18种物质，受害葡萄有13种物质(图2)。健康与受害两种条件下均能引起触角电位反应的物质有8种，分别为丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、己醇、2-己烯酸乙酯、顺-3-己烯醇、壬醛和一种未鉴定物质；健康状态下能够引起触角电位反应的特有成分有7种，分别为2-丁烯酸乙酯、庚醛、3-己烯酸乙酯、顺-2-己烯醇、丁酮肟、(E,Z)-2,4-癸二烯酸乙酯和一种未鉴定物质；受害状态下有5种物质为特有成分，包括乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、3-蒈烯、3-羟基-2-丁酮和一种未鉴定物质(图2; 表1)。

图2 白星花金龟雌成虫对葡萄挥发物的GC-EAD反应

2.3 白星花金龟雌成虫对玉米挥发物的GC-EAD反应

玉米果实共有25种具有电生理活性的挥发物，其中健康玉米有9种，受害玉米23种(图3)。两种状态下均能引起触角电位反应的物质有7种，分别是1-戊烯-3-醇、顺-2-戊烯醇、1,4-戊二烯-3-醇、己醇、顺-2-己烯醇、香叶基丙酮和一种未鉴定物质。健康状态下能够引起触角电位反应的特有成分有2种，分别为α-叩卜任烯和1种未鉴定物质。受害状态下特有成分有16种，分别为3-己酮、3-甲基丁酸乙酯、己醛、β-蒎烯、4-庚酮、丙酸丁酯、3-蒈烯、2-庚酮、D-柠檬烯、2-戊基呋喃、戊醇、4-庚醇、顺-3-己烯醇、反-2-己烯醇、芳樟醇和γ-己内酯(图3; 表1)。

图3 白星花金龟雌成虫对玉米挥发物的GC-EAD反应

表1 3种果实两种状态下挥发物中对白星花金龟雌成虫有EAD活性的成分

2.4 触角电生理活性成分的主成分分析(PCA)及聚类分析(CA)

根据58种成分的主成分分析结果， 4个主成分可解释的方差百分比能达到72.8%。前两个PCA成分能够解释总变异程度的48.5%，其中第一主成分对总挥发物的解释程度为28.3%， 第二主成分为20.2%(图4)。 根据主成分1和2的聚类分析结果，可将6个处理的挥发物大致分成5组(图5)，分别为来自健康苹果(G1)、 受害苹果(G2)、 健康葡萄+受害葡萄(G3)、健康玉米(G4)和受害玉米(G5)。

续表1 Table 1 continued

图4 不同状态下3种果实挥发物主成分分析

图5 基于不同状态下3种果实挥发物主成分1和2的聚类分析谱系图

根据各成分在主成分分析中所占权重，苹果中的释放量高于其他处理的有14种，将受害苹果与健康苹果很好地分离开(图4)，包括11种酯(2-甲基丁酸甲酯、乙酸丁酯、2-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁酸丙酯、乙酸戊酯、己酸甲酯、丁酸丁酯、乙酸己酯、己酸丙酯、异戊酸己酯和辛酸乙酯)、2种醇(2-甲基丁醇和3-甲基-3-丁烯-1-醇)和1种萜烯(α-法尼烯)。受害后含量显著下降的成分为7种酯和1种醇，包括2-甲基丁基乙酸酯、 2-甲基丁酸丙酯、 乙酸戊酯、己酸甲酯、丁酸丁酯、乙酸己酯、异戊酸己酯和己醇，显著上升的为1种酯和2种醇，包括己酸乙酯、2-甲基丙醇和2-甲基丁醇(表1)。

葡萄中释放量高于其他处理的成分有15种，但未能将健康与受害葡萄分离(图4)。包括9种酯(乙酸异丁酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、戊酸乙酯、2-丁烯酸乙酯、己酸乙酯、3-己烯酸乙酯、2-己烯酸乙酯和(E,Z)-2,4-癸二烯酸乙酯)，2种醛(庚醛和壬醛)、1种酮(3-羟基-2-丁酮)、1种醇(2-甲基丙醇)、1种萜烯(3-蒈烯)和1种肟(丁酮肟)。受害后含量显著上升的成分包括1种酯和3种醇，为2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丙醇、己醇和顺-3-己烯醇(表1)。

玉米中释放量高于其他处理的成分有21种，较好地将健康与受害玉米分离(图4)。包括10种醇(1-戊烯-3-醇、戊醇、4-庚醇、顺-2-戊烯醇、1,4-戊二烯-3-醇、己醇、顺-3-己烯醇、顺-2-己烯醇、反-2-己烯醇和芳樟醇)、4种酮(3-己酮、4-庚酮、2-庚酮和香叶基丙酮)、3种酯(3-甲基丁酸乙酯、丙酸丁酯和γ-己内酯)、2种萜烯(D-柠檬烯和α-叩卜任烯)、1种醛(己醛)和1种呋喃(2-戊基呋喃)。根据统计分析结果发现，仅顺2-己烯醇含量在受害后显著降低(表1)。

3 讨论与结论

苹果、葡萄和玉米等3种寄主果实受害前、后能够引起白星花金龟雌成虫触角电位反应的挥发物共有58种(表1)，部分活性物质如己醛、壬醛、己醇、反-2-己烯醇、顺-3-己烯醇、2-甲基丁醇、芳樟醇、2-甲基丁基乙酸酯、己酸乙酯、乙酸己酯和3-羟基-2-丁酮等，在前人的研究中已有报道(Chen and Li, 2011; 龚建, 2017; 王瑞笛和王少山, 2018; 王瑞笛, 2019)。有些活性物质对其他金龟甲也具有电生理活性，如己醛、壬醛和芳樟醇等能够引起高粱花金龟Pachnodainterrupta的触角电位反应(Bengtssonetal., 2009)；乙酸异戊酯和丁酸乙酯等能引起鳃金龟Holotrichiaserrata的电生理活性(Subaharanetal., 2013)；己醇和反-2-己烯醇能引起欧洲金龟Melolonthamelolontha的电生理反应等(Andreasetal., 2005)。有些物质还能引起白星花金龟和其他金龟的行为反应，如壬醛、己醛、反-2-己烯醛、己醇、反-2-己烯醇、芳樟醇、乙酸丁酯和苯酚等对白星花金龟成虫具有吸引作用(王清华和张金桐, 2008; 王瑞笛和王少山, 2018; 王瑞笛, 2019)；顺-3-己烯醇、芳樟醇、α-法尼烯对日本丽金龟具明显的吸引作用(Loughrinetal., 1995)；日本丽金龟P.japonica引诱剂(丙酸苯乙酯∶丁香酚∶香叶醇，3∶ 7∶3)对白星花金龟具也有引诱作用(Ladd and McGovern, 1980)；顺-3-己烯醇、丁酸丁酯对高粱花金龟具有显著吸引作用(Wolde-Hawariatetal., 2007; Bengtssonetal., 2009)。这些常见的能够引起金龟触角电位及行为反应的活性物质对开发白星花金龟引诱剂具有重要的参考价值。

金龟甲的取食会导致寄主挥发物的成分发生质和量的改变，进而影响金龟的寄主定位(Stensmyretal., 2001)。主成分分析及统计分析结果表明3种果实之间挥发物差异较大，能够显著代表苹果、葡萄和玉米果实的挥发性气味分别有14, 15和21种，这些代表性成分可较好地区分健康、受害两种状态下的苹果和玉米，但无法区分两种状态下的葡萄，这可能与白星花金龟区分寄主状态时的难易程度有关，白星花金龟可能更难以区分健康和受害状态下的葡萄。果实受害前、后释放的挥发物中对白星花金龟雌成虫有电生理活性的成分以酯类和醇类为主。除受害前、后的特有成分外，释放量显著减少的酯有7种(2-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁酸丙酯、乙酸戊酯、己酸甲酯、丁酸丁酯、乙酸己酯和异戊酸己酯)；释放量显著增加的醇有3种(2-甲基丙醇、2-甲基丁醇和顺-3-己烯醇)，说明白星花金龟的取食能够抑制3种果实中部分酯的释放，促进部分醇的释放。此外，白星花金龟能诱导果实释放新的醇(3-甲基-3-丁烯-1-醇、戊醇、4-庚醇、芳樟醇和反-2-己烯醇)、酮(3-己酮、4-庚酮、2-庚酮和3-羟基-2-丁酮)和萜烯(3-蒈烯、D-柠檬烯和β-蒎烯)。喜好聚集为害的昆虫对虫害诱导的植物挥发物通常有较强的行为反应。如3-甲基-3-丁烯-1-醇对落叶松八齿小蠹Ipssubelongatus有引诱作用(Zhangetal., 2007)；欧洲鳃金龟Melolonthamelolontha雌虫取食诱导的己醇、反-2-己烯醇和顺-3-己烯醇对雄虫有显著的吸引作用(Reineckeetal., 2005)；Y型嗅觉仪行为实验证明葡萄受害后的特有成分3-羟基-2-丁酮、玉米受害后产生的己醛对白星花金龟成虫具有引诱作用(王瑞迪, 2019)；乙酸异戊酯对高粱花金龟P.interrupta具有引诱作用(Wolde-Hawariatetal., 2007)；玉米受害后产生的β-蒎烯对花金龟Pachnodamarginata具有引诱作用(Larssonetal., 2003)。因此，研究寄主植物受害前后释放的挥发物的变化可能有助于解释白星花金龟更趋向于受害果实的集群危害习性。

利用嗅觉电生理和室内行为实验寻找活性物质用于田间测试，是开发植物源诱剂的常用手段(Dickensetal., 1991; Zhangetal., 2007; Bengtssonetal., 2009)。那些对白星花金龟具有室内行为活性的挥发物，可直接用于田间诱集试验，而那些有电生理活性但未测试室内行为反应的挥发物，可同时开展室内行为测试与田间诱集效果筛选。