抗凝治疗与房颤患者血浆神经源性外泌体中T⁃tau蛋白和Aβ1⁃42含量变化的关系

杜美玲 王晓元 张爱爱 郝翠君 张鹏祥

河北北方学院附属第一医院（河北张家口 075400）

在过去的20年中，房颤已经成为最重要的公共卫生问题之一，并且是西方国家医疗保健成本增加的重要原因。中国痴呆患者的数量约占全球痴呆患者总数的25%。越来越多的证据表明，无论房颤患者是否合并脑卒中，房颤与认知功能障碍都显著相关［1］。在没有临床卒中的情况下，房颤患者比无房颤病史的患者更早达到认知障碍或痴呆的阈值［2］，房颤与认知功能障碍的高风险独立相关［3］。随着房颤的流行性和其预期寿命的增加，这些与房颤相关的认知障碍的患病率预计将显著上升。房颤患者的抗凝治疗是房颤治疗的重要内容，能够显著降低栓塞风险，同时对患者的认知功能存在保护作用［4］。本研究检测了房颤合并认知功能障碍患者外周血神经源性外泌体为载体的T⁃tau 蛋白及Aβ1⁃42 含量，并分析抗凝治疗对此水平的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2020年4月至2020年8月在我院心血管内科住院且符合入选条件的房颤患者作为研究对象，按照是否进行抗凝治疗分为两组，其中抗凝治疗组包括40 名患者，未进行抗凝治疗组100 名患者。基于简易精神状态做检查（MMSE）评分的痴呆症纳入标准因文化程度不同而异：文盲<17分，小学<20分，初中及以上<24 分，同时，临床痴呆评分（clinical dementia rating，CDR）≥1和缺血指数（Hachinski⁃lnchemic 评分，HIS）≤4；基于MMSE 评分的轻度认知功能障碍（MCI）纳入标准：文盲>17分，小学>20分，初中及以上>24分，同时CDR ≤0.5 和HIS ≤4。对所有患者进行认知功能评分，包括96 名认知功能障碍（cognitive im⁃pairment，CI）患者（其中45 名痴呆患者，51 名轻度认知功能障碍患者）和44 名认知功能正常患者（cognitive normal，CN）。表1列出了研究人群的人口统计学和临床特征。依据房颤患者是否抗凝治疗进行分组，两组患者的年龄、女性比例、BMI、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病分布差异均无统计学意义（P>0.05），其教育水平均存在显著性差异（P<0.01）。所有知情同意书均已由参与者或其法定监护人签署。本研究由河北北方学院附属第一医院机构伦理审查委员会审查和批准（伦理批号：K2017179）。

表1 患者临床特征Tab.1 Clinical characteristics of patients例（%）

1.2 收集外周血神经源性外泌体禁食12 h 后早晨采集5 mL 全血于EDTA 抗凝管中，3 000×g离心15 min，分离的血浆收集在2 mL 无菌管中，获得用于提取外泌体的血浆，储存在-80 ℃冰箱中；血浆样品在4 ℃下解冻，3 000×g4 ℃离心10 min，继以10 000×g4 ℃下离心20 min 以去除细胞碎片和杂质；0.5 mL 上清液用在4 ℃下预冷的2 mL 1×磷酸盐缓冲盐水（PBS，HyClone）稀释，添加0.5 mL 血液纯化液（BPS，Umibio）试剂；在4 ℃下培养2 h 后，将混合溶液在10 000×g4 ℃下离心60 min 以获得沉淀外泌体颗粒；将外泌体重新悬浮在200 μL PBS 中，然后将悬浮混合物在12 000×g4 ℃下离心2 min。保留富含外泌体的上清；在3 000×g4 ℃下离心10 min 的外泌体纯化过滤器进行纯化。将每个样品与1 μg小鼠抗人L1细胞黏附分子（L1CAM）单克隆生物素化抗体（Thermo Fisher Scientific）和50 μL 3%牛血清白蛋白（BSA，Sigma）混合，4 ℃下培养60 min；添加25 μL 链霉亲和素琼脂糖树脂（Thermo Fisher Scientific）和50 μL 3%BSA，在4 ℃下储存30 min；在4 ℃下以400×g离心10 min，去除上清液；50 μL 0.05 mol/L 甘氨酸盐酸（pH=3.0）添加到沉淀物中并涡旋混匀10 s；添加0.45 mL DBS⁃2、2 g/100 mL BSA、0.10%吐温20和抑制剂混合物后，将悬浮液涡旋混合，并在37 ℃下孵育10 min；所有样品均储存在-80 ℃下直至酶联免疫吸附试验（ELISA）。

1.3 外泌体的验证观察神经源性外泌体固定在适合用于透射电子显微镜（TEM）的铜网栅上。铜网上的外泌体用草酸铀酰和甲基纤维素溶液呈阴性染色。使用Talos F200C TEM（Thermo Fisher Sci⁃entific）进行成像。以细胞裂解液作为阳性对照，用小鼠抗人CD63 抗体（1∶1 000，abcam）及TSG101抗体（1∶1 000，abcam）进行Western blot 以检测外泌体标记物。

1.4 神经源性外泌体中T⁃tau 蛋白及Aβ1⁃42 含量的测定专用外泌体裂解液（Umibio，中国）裂解外泌体后，采用ELISA 检测神经源性外泌体中Aβ42，T⁃tau 蛋白的含量。测定神经元源性外泌体中CD63 蛋白的含量，校正外泌体的含量。

1.5 统计学处理采用SPSS 25.0统计软件对数据进行分析，计量资料采用（±s）表示，计量资料组间比较服从正态分布及方差齐性时采用t检验，不符合正态分布时采用非参数秩和检验；计数资料采用例（%）表示，组间比较采用卡方检验。P<0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗凝治疗对认知功能的影响房颤患者抗凝治疗和无抗凝治疗时的认知功能MMSE 评分差异有统计学意义（图1，25.48±4.15vs.20.58±5.26，P<0.001）；抗凝治疗与未抗凝治疗两组间认知功能正常、轻度认知功能障碍与痴呆分布差异有统计学意义（图2，Z=-4.275，P<0.001）。

图1 抗凝治疗组间MMSE 比较Fig.1 Comparison of MMSE between anticoagulant treatment groups

图2 抗凝治疗组间认知功能分布差异Fig.2 Distribution difference of cognitive function between anticoagulant treatment groups

采用二元logistic 回归方法分析房颤患者认知功能障碍的危险因素，以输入法作为自变量筛选方法，教育程度及房颤病程变量作为连续变量输入模型（表2），分析患者年龄、性别、教育程度、吸烟史、饮酒史、高血压、糖尿病、房颤病程以及未抗凝治疗与认知功能障碍之间的关系（表3），结果发现教育程度是房颤患者认知功能的保护因素（B=-0.526，P<0.001），房颤患者未抗凝治疗较抗凝治疗患者认知功能障碍的风险显著增加（OR=5.024，95%CI：1.584～15.936，P<0.01），证明房颤的抗凝治疗是认知功能的保护因素。自变量间多重共线性诊断的标准是容差>0.1 和差异膨胀系数<10，未发现共线性存在。

表2 房颤患者认知功能影响因素的变量赋值Tab.2 Assignment of influencing factors of cognitive function in patients with atrial fibrillation

表3 房颤患者认知功能影响因素的logistic 分析结果Tab.3 Results of logistic analysis on influencing factors of cognitive function in patients with atrial fibrillation

2.2 外泌体的观察确认透射电子显微镜下可以观察到大小均匀、形态一致的呈圆形或椭圆形囊泡的血浆外泌体（图3）可见其膜性结构。Western blot 分析证实了CD63 及TSG101 在外泌体样本中的表达（图4）。

图3 透射电子显微镜观察血浆外泌体形态结构Fig.3 Morphological structure of plasma exosomes observed by transmission electron microscope

图4 CD63 抗体及TSG101 抗体Western blot 检测结果Fig.4 Western blot detection of CD63 antibody and TSG101 antibody

2.3 抗凝治疗对血浆神经源性外泌体中T⁃tau 蛋白及Aβ1⁃42 含量的影响T⁃tau 蛋白及Aβ1⁃42 在两组中的含量分布如表4所列，抗凝治疗组患者血浆神经源性外泌体中T⁃tau 和Aβ1⁃42 的含量显著低于未抗凝治疗组（表4，P<0.001）。

表4 T⁃tau 蛋白及Aβ1⁃42 在两组中的含量Tab.4 Contents of t⁃tau protein and Aβ1⁃42 in the two groups x±s，pg/mL

3 讨论

房颤是发病率最高的心律失常，同时是已证实的认知功能障碍的独立危险因素［5-7］。本研究结果中校正人口统计学特征和共病条件后，房颤患者未抗凝治疗较抗凝治疗，发生认知功能障碍的风险是5 倍，证实抗凝治疗对房颤患者的认知功能具有保护作用。已有大量研究证实进行抗凝治疗能显著降低房颤患者认知功能障碍风险［8］。抗凝药物种类选择在降低痴呆风险上是否存在差异尚有争议。有研究显示长期服用华法林与新型口服抗凝药（new oral anticoagulants，NOAC）对比，在降低认知功能减退和痴呆的发生风险上并无显著差异［9］。也有大量研究、系统回顾和荟萃分析表明，NOAC 在预防房颤痴呆方面优于华法林［10-13］。

本试验中房颤患者未抗凝治疗组轻度认知功能障碍及痴呆的发生率显著增加，同时定量检测患者T⁃tau 蛋白及Aβ1⁃42 这两种阿尔茨海默病的标志蛋白，对比两组中蛋白含量差异，发现抗凝治疗组患者血浆神经源性外泌体中T⁃tau 和Aβ1⁃42的含量显著低于未抗凝治疗组，从而进一步证明房颤患者的抗凝治疗不仅有助于预防栓塞事件，同时对患者的认知功能有明显的保护作用，能够显著降低房颤患者认知功能障碍和痴呆的风险。房颤患者的认知功能障碍可能由退行性疾病引起，主要类型为阿尔茨海默病，但其分子机制尚不清楚。阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种神经退行性疾病，是导致痴呆的主要原因，尤其以β⁃淀粉样蛋白沉积形成老年斑及tau 蛋白聚集形成神经元纤维缠结为主要特征［14］。β⁃淀粉样蛋白中由40 个和42 个氨基酸残基组成的Aβ1⁃40和Aβ1⁃42 含量最多，大量Aβ 沉积，形成以Aβ 为核心的无法溶解的纤维蛋白斑块即老年斑［15］。病理情况下，大量过度磷酸化的tau 蛋白失去了结合微管的能力，容易沉积聚集形成神经元纤维缠结。在基于人群的尸检研究中，与无房颤病史的人群相比，如老年斑和神经元纤维缠结的AD 神经病理学变化，在房颤的人群中更常见，提示房颤可能与AD 的神经病理学改变有关。房颤诱发认知功能损害可能有不同的机制，脑灌注不足、微出血、微栓塞和其他异常血流动力学过程被认为是房颤患者发生CI 的可能机制［16-17］。同时炎症和血脑屏障损伤可能是房颤患者发生认知功能障碍的相关机制［18］。

由于血脑屏障存在，导致外周血检测神经源性蛋白困难，本试验采用免疫沉淀法富集神经源性外泌体，进而检测神经源性外泌体中相关蛋白含量。外泌体尺寸非常小，并具有细胞膜样结构，使它们能够轻松地穿过血脑屏障。例如，在tau 基因敲除小鼠侧脑室内注射放射性标记的tau 蛋白，然后观察到来自神经源性外泌体的相应tau 蛋白［19］，表明外泌体可以携带生物物质穿过脑细胞及血脑屏障。一项多中心两阶段的研究显示，T⁃tau 和Aβ1⁃42 以神经源性外泌体为载体的浓度与其脑脊液中含量具有相同的诊断AD 和轻度认知功能障碍的能力［20］。上述数据表明，外周血神经源性外泌体是筛选认知功能障碍的神经退行性生物标志物的良好载体。

本研究存在一些局限性，不能完全排除无明显临床症状的微血栓形成事件，抗凝治疗可减少微血栓事件的发生，从而保护房颤患者的认知功能，因此不能完全排除血管性痴呆对结论的干扰。本研究入选永久性房颤患者时排除既往脑血管病史患者，以上筛选条件导致符合入选条件的样本例数受限，需要继续扩大样本进一步支持本研究结论。本研究首次检测分析了房颤合并认知功能障碍患者外周血神经源性外泌体为载体的T⁃tau 蛋白及Aβ1⁃42 含量，发现进行抗凝治疗的房颤患者其生物标志物水平显著低于未抗凝治疗组，进一步证实了抗凝治疗对房颤患者的认知损害有保护作用，提示抗凝药物有预防延缓认知功能障碍及痴呆的发生。临床可以参考生物标志物早期识别认知功能障碍并积极预防，同时应指导患者合理选择抗凝药物，预防栓塞事件同时预防认知功能障碍及痴呆的发生。