决明子总蒽醌调控Sirt1/PPARγ 通路对H2O2诱导人晶状体上皮细胞氧化损伤的影响

何宇，杨德，严宏

白内障是以晶状体进行性混浊为主要特征的致盲性眼病，是全球中老年群体致盲、视力损害的重要原因，而晶状体混浊主要由晶状体上皮细胞（lens epithelial cell，LEC）损伤引起[1]。研究[2-3]报道，细胞代谢产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可引起氧化应激反应，造成LEC 损伤，最终导致晶状体细胞发生凋亡或结构改变。目前，手术是治疗白内障的唯一有效方法，但手术并发症、经济费用、地域技术水平限制了白内障手术的开展。因而，通过药物有效拮抗氧化应激引起的LEC 损伤防治白内障越来越引起人们重视[4]。决明子总蒽醌（cassia seed total anthraquinone，CSTA）是决明子的主要有效成分之一，具有降脂、降压、抗炎、抗氧化应激、抗衰老、增强免疫功能等作用[5]。研究[6-7]显示，CSTA 可激活抗氧化应激途径及抗炎途径，介导肝保护作用。沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，Sirt1）是第Ⅲ类去乙酰化酶家族成员，可抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）活性发挥抗氧化应激、抗炎作用，参与白内障发病[8-10]。本研究将从Sirt1/PPARγ 通路角度探讨CSTA 对H2O2诱导人LEC 氧化损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

人LEC 细胞系HLE-B3 细胞（美国ATCC 公司，H-HLE-B3），DMEM 培养基（北京索莱宝科技有限公司，90113），2%CSTA（兰州沃特莱斯生物科技有限公司，WTLS-061112），并由本实验室进一步提取，Sirt1 抑制剂EX527、四甲基偶氮唑盐比色法（methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT）试剂（上海吉至生化科技有限公司，E46900-5 mg、AM1020-500T），实时荧光定量PCR 试剂盒（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）、Annexin V-FITC/PI试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，ALH197-VNA、WE0325-HYB），丙二醛（malonydialdehyed，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、酶联免疫（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）（上海哈灵生物科技有限公司，HL10336、HL10208、HL10249），兔抗Sirt1 抗体、兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体、羊抗兔IgG 二抗（美国abcam 公司，ab32441、ab181602、ab6721），兔抗p-PPARγ 抗体、兔抗PPARγ 抗体（美国Bioworld 公司，AP0688、BS4444）。

酶标仪（美国Thermo 公司，MK3），流式细胞仪（美国Millipor 公司，Guauasoft 6L），qRT-PCR 仪（美国QIAGEN 公司，Rotor-Gene Q），凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司，GS-800）。

1.2 细胞培养及分组

用含20%胎牛血清的DMEM 培养基培养HLE-B3 细胞，37℃、5%CO2培养箱中常规培养，细胞接近融合时传代，取对数期细胞进行实验。

HLE-B3 细胞分组和处理的2 种方式：①浓度筛选，分别加入不同梯度终浓度0、5、10、20、40、80、160 mg/L 的CSTA 处理24 h，加入100 μmol/L 的H2O2处理12 h，用于设定后续实验的CSTA 最佳处理浓度；②正式实验，分为对照组（control group，CG组），不进行任何处理；H2O2组，给予100 μmol/L H2O2处理12 h；CSTA 组，给予20 mg/L CSTA 处理24 h 后，再加入100 μmol/L H2O2处理12 h；Sirt1 抑制剂组（EX527 组），给予10 μmol/L EX527 预处理30 min 后，加入20 mg/L CSTA 处理24 h，再加入100 μmol/L H2O2处理12 h。

1.3 MTT 法检测HLE-B3 细胞活力

HLE-B3 细胞以1×105个/孔接种在96 孔板，分别按1.2 中①、②进行分组处理，培养24 h，每孔加20 μL 的MTT 试剂，培养4 h 后弃培养液，每孔加200 μL 二甲基亚砜溶液，常温震荡20 min，用酶标仪（490 nm 波长）测定各孔光密度值（optical density，OD），计算细胞活力。细胞活力=（OD实验组/OD对照组）×100%。

1.4 流式细胞仪检测HLE-B3 细胞凋亡情况

HLE-B3 细胞以1×105个/孔接种在96 孔板，按1.2 中分组②进行处理，培养24 h 收集，调整为1×106个/mL，加AnnexinV-FITC 试剂、PI 试剂各10μL，避光孵育20 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 ELISA 法检测HLE-B3 细胞内MDA、GSH-Px和SOD 表达

HLE-B3 细胞以1×105个/孔接种在96 孔板，按1.2 中分组②进行处理，培养24 h 收集，用细胞裂解液裂解20 min，离心分离上清，用MDA、GSH-Px、SOD 的ELISA 试剂盒处理，在酶标仪上检测MDA、GSH-Px 和SOD 含量。

1.6 qRT-PCR 法检测HLE-B3 细胞内Sirt1、PPARγ mRNA 表达

HLE-B3 细胞以5.0×105个/孔接种在24 孔板，按1.2 中分组②进行处理，培养24 h 收集，提取总RNA 并合成cDNA，按照qRT-PCR 试剂盒说明书配制反应体系，以GAPDH 为内参基因，于qRT-PCR仪上检测Sirt1、PPARγ mRNA 表达水平，结果以2-ΔΔCt法表示，引物序列如表所示（表1）。

表1 引物序列

1.7 Western Blot 检测HLE-B3 细胞内Sirt1/PPARγ通路相关蛋白水平

HLE-B3 细胞以5.0×105个/孔接种在24 孔板，按1.2 中分组②进行处理，培养24 h 收集，提取总蛋白并定量，将蛋白样品变性、电泳、转膜、封闭后，加入一抗（兔抗Sirt1 抗体、兔抗p-PPARγ 抗体、兔抗PPARγ 抗体、兔抗GAPDH 抗体，稀释比例1∶500、1∶1,000、1∶1,000、1∶400），4℃孵育过夜后，加入二抗（羊抗兔IgG，稀释比例1∶1,000）室温孵育1 h，化学发光显影，扫描图像，以GAPDH 为内参，分析目的蛋白相对灰度值。

1.8 统计学分析

采用SPSS21.0 统计软件对数据进行分析，计量资料数据采用均数±标准差（）表示，计量资料采用方差分析（ANOVA）进行多组变量间的相互比较，两两比较采用LSD-t 检验，当P＜0.05 时被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同CSTA 浓度对H2O2 诱导的HLE-B3 细胞活力的影响

不同CSTA 浓度组细胞活力比较，差异有统计学意义（F=60.402，P=0.000）。组间两两比较，与0 mg/L相比，5、10、20、40、80、160 mg/L CSTA 均可显著提高H2O2诱导的HLE-B3 细胞活力（t5=5.980，t10=10.261，t20=14.555，t40=16.334，t80=16.052，t160=15.091，均P=0.000）。随着CSTA 浓度的升高，H2O2诱导的HLE-B3细胞活力在0～20 mg/L 范围内两相邻浓度的变化差异有统计学意义（0～5mg/L：t=5.980，P=0.000；5～10mg/L：t=4.333，P=0.001；10～20 mg/L：t=3.934，P=0.003），在20 mg/L～160 mg/L 范围内两相邻浓度的变化差异均无统计学意义（P＞0.05）。故选择20 mg/L 作为后续实验的CSTA 处理浓度（表2）。

表2 不同CSTA 浓度对H2O2 诱导HLE-B3 细胞细胞活力比较（，n=6）

表2 不同CSTA 浓度对H2O2 诱导HLE-B3 细胞细胞活力比较（，n=6）

注：* 与0 mg/L 相比，P＜0.05；# 与5 mg/L 相比，P＜0.05；&与10 mg/L相比，P＜0.05；@ 与20 mg/L 相比，P＜0.05。CSTA 决明子总蒽醌

2.2 CSTA 对HLE-B3 细胞活力的影响

4 组细胞活力比较，差异有统计学意义（F=104.043，P=0.000）。组间两两比较，与CG 组（100.00±0.00）%相比，H2O2组HLE-B3 细胞活力（36.58±6.74）%显著降低（t=23.048，P=0.000）；与H2O2组相比，CSTA 组（62.53±8.96）%显著升高（t=5.669，P=0.000）；与CSTA 组相比，EX527 组（42.14±8.03）%降低（t=4.151，P=0.002），均有统计学意义。

2.3 CSTA 对HLE-B3 细胞凋亡的影响

4 组细胞凋亡比较，差异有统计学意义（F=143.552，P=0.000）。组间两两比较，与CG 组（7.32±1.96）%相比，H2O2组HLE-B3 细胞凋亡率（31.84±2.68）%显著升高（t=18.480，P=0.000）；与H2O2组相比，CSTA 组凋亡率（19.01±2.15）%显著降低（t=9.670，P=0.000）；与CSTA 组相比，EX527 组凋亡率（29.60±2.34）%升高（t=7.982，P=0.000），均有统计学意义（图1）。

图1 决明子总蒽醌对HLE-B3 细胞凋亡的影响。1A 对照组；1B H2O2 组；1C 决明子总蒽醌组；1D 沉默信息调节因子1 抑制剂组

2.4 CSTA 对HLE-B3 细胞内MDA、GSH-Px 和SOD表达的影响

4 组MDA、GSH-Px 和SOD 表达比较，差异均有统计学意义（FMDA=76.167，FGSH-Px=104.781，FSOD=100.392，均P=0.000）。两两比较，与CG组相比，H2O2组HLE-B3 细胞内MDA 含量显著升高（t=13.040，P=0.000），GSH-Px、SOD 含量显著降低（tGSH-Px=15.220，tSOD=14.930，均P=0.000）。与H2O2组相比，CSTA 组HLE-B3 细胞内MDA 含量显著降低（tCSTA=9.602，P=0.000），GSH-Px、SOD 含量显著升高（tGSH-Px=11.810，tSOD=11.150，均P=0.000）。与CSTA 组相比，EX527 组HLE-B3 细胞内MDA 含量显著升高（t=7.575，P=0.000），GSH-Px、SOD 含量显著降低（tGSH-Px=9.090、tSOD=8.783，均P=0.000），均有统计学意义（表3）。

表3 对HLE-B3 细胞内MDA、GSH-Px 和SOD 的影响（，n=6）

表3 对HLE-B3 细胞内MDA、GSH-Px 和SOD 的影响（，n=6）

注：* 与CG 组相比，P＜0.05；# 与H2O2 组相比，P＜0.05；&与CSTA 组相比，P＜0.05。CG 对照组；H2O2 过氧化氢组；CSTA 决明子总蒽醌组；EX527 沉默信息调节因子1 抑制剂组；MDA 丙二醛；GSHPx 谷胱甘肽过氧化物酶；SOD 超氧化物歧化酶

2.5 CSTA 对HLE-B3 细胞内Sirt1、PPARγ mRNA表达的影响

4 组间HLE-B3 细胞内PPARγ mRNA 水平，差异无统计学意义（P＞0.05）。4 组Sirt1mRNA 表达比较，有统计学意义（F=182.439，P=0.000）。与CG 组相比，H2O2组Sirt1mRNA 水平显著降低（t=33.803，P=0.000）。与H2O2组相比，CSTA 组Sirt1 mRNA 水平显著升高（t=13.561，P=0.000）。与CSTA组相比，EX527组Sirt1 mRNA 水平显著降低（t=10.312，P=0.000），均有统计学意义（表4）。

2.6 CSTA 对HLE-B3 细胞内Sirt1/PPARγ 通路相关蛋白表达的影响

4组间HLE-B3细胞内Sirt1蛋白表达比较，差异有统计学意义（F=54.370，P=0.000）。4组间p-PPARγ/PPARγ 蛋白表达比较，差异有统计学意义（F=127.554，P=0.000）。与CG组相比，H2O2组HLE-B3 细胞内Sirt1 蛋白水平显著降低（t=11.000，P=0.000），p-PPARγ/PPARγ 蛋白水平显著升高（t=16.410，P=0.000）。与H2O2组相比，CSTA 组HLE-B3 细胞内Sirt1 蛋白水平显著升高（t=7.667，P=0.000），p-PPARγ/PPARγ 蛋白水平显著降低（t=13.060，P=0.000）。与CSTA 组相比，EX527组HLE-B3细胞内Sirt1蛋白水平显著降低（t=6.333，P=0.000），p-PPARγ/PPARγ蛋白水平显著升高（t=10.630，P=0.000），均有统计学意义（图2、表4）。

图2 决明子总蒽醌对HLE-B3 细胞内Sirt1、p-PPARγ、PPARγ 蛋白表达的影响

表4 决明子总蒽醌对HLE-B3 细胞内Sirt1、PPARγ mRNA表达的影响（，n=6）

表4 决明子总蒽醌对HLE-B3 细胞内Sirt1、PPARγ mRNA表达的影响（，n=6）

注：* 与CG 组相比，P＜0.05；# 与H2O2 组相比，P＜0.05；&与CSTA 组相比，P＜0.05。CG 对照组；H2O2过氧化氢组；CSTA 决明子总蒽醌组；EX527 Sirt1 抑制剂组；Sirt1 沉默信息调节因子1；PPARγ 过氧化物酶体增殖物激活受体γ

3 讨论

白内障是严重危害中老年人眼部健康的致盲性眼病，近年来随着老龄化社会的到来，其危害越来越受到人们重视。目前白内障发病机理尚不完全明确，相关假说有氧化应激损伤学说、细胞凋亡学说、醌体学说、琉基理论、离子转运障碍学说、内分泌紊乱学说等[11]。近年来，细胞凋亡在各种疾病的进展机制方面的研究取得了巨大进展。越来越多的证据表明，氧自由基损伤导致的LEC 凋亡是除了先天性白内障以外的各种类型白内障发生的共同机制[12]。在正常生理条件下，晶状体内氧自由基的生成与消除是平衡的。但发生氧化应激时，细胞内氧自由基清除能力明显下降，聚集过量会导致LEC 发生氧化损伤并触发细胞凋亡[13]。H2O2是引起氧化应激的危险因子之一，本研究以HLE-B3 细胞为研究对象，利用H2O2建立细胞的氧化损伤模型，观察CSTA 对该细胞氧化应激损伤的保护作用。

CSTA 是中药材决明子的主要有效成分之一，而现代药理学研究表明，决明子具有良好的抗炎、抗氧化、抗纤维化、降血压等多种生物学功能[14-16]。本研究通过浓度梯度实验选择20 mg/L 作为CSTA 的实验浓度，发现CSTA 能显著提高H2O2诱导的HLE-B3 细胞活力，降低细胞凋亡率，提示CSTA 对H2O2诱导的HLE-B3 细胞损伤具有保护作用。同时，CSTA 能显著提高H2O2诱导的HLE-B3 细胞内GSH-Px、SOD 含量，并降低MDA 含量，提示CSTA能加强HLE-B3 细胞内的抗氧化应激反应，对抗H2O2诱导的氧化应激反应，减轻HLE-B3 细胞氧化应激损伤，但具体作用机制尚需进一步探讨。

PPARγ 是配体激活依赖的核受体转录因子，调节多种因子的转录活性，在机体糖代谢、脂质平衡、炎症反应、氧化应激反应、免疫反应及细胞分化、增殖等方面均具有重要调控作用[17-18]。Sirt1 是具有烟酰胺腺苷二核苷酸依赖性的去乙酰化酶，能调节许多转录因子，发挥抗炎、抗氧化应激及调节细胞免疫等功能[19-20]。研究[21]发现，PPARγ 是Sirt1 的底物之一，Sirt1 可抑制PPARγ 活性，参与脂质代谢过程的调节。本研究显示，H2O2可降低HLE-B3 细胞内Sirt1 mRNA 及蛋白水平，提高PPARγ 磷酸化蛋白水平，提示Sirt1/PPARγ通路参与H2O2诱导的HLE-B3 细胞氧化应激损伤过程。使用CSTA 可提高H2O2诱导的HLE-B3 细胞内Sirt1 mRNA 及蛋白水平，并降低PPARγ 磷酸化蛋白水平，提示CSTA 能调节Sirt1/PPARγ 通路。进一步使用Sirt1 抑制剂后发现，HLE-B3 细胞内Sirt1 mRNA 及蛋白水平降低，PPARγ 磷酸化蛋白水平升高，同时HLE-B3 细胞活力及细胞内GSH-Px、SOD 含量降低，细胞凋亡率及细胞内MDA 含量升高，提示CSTA 可能通过调节Sirt1/PPARγ 通路，进而增强抗氧化应激反应，提高HLE-B3 细胞活力，减少细胞凋亡。

综上所述，CSTA 能增强H2O2诱导的HLE-B3细胞内的抗氧化应激反应，提高细胞活力并减少氧化应激损伤导致的细胞凋亡，其机制与调节Sirt1/PPARγ 通路有关。此发现可为临床研制白内障治疗药物提供新思路，但本研究仅能证明CSTA 对体外H2O2诱导HLE-B3 细胞氧化应激凋亡的影响，对白内障动物体内LEC 损伤的影响还需进一步开展动物实验进行研究。