桑色素对SO-Rb50 细胞增殖和转移能力的抑制作用研究

孔林，周鲜琳，赵明飞，张晓月，余秋林

视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）是一种儿童常见的眼内恶性肿瘤[1]。与其他类型的恶性肿瘤相比，Rb 发生率相对较低，在全球范围内，1.8 万～3.0 万名婴儿中，只有1 名婴儿会出现Rb[2]。如果没有适当的治疗，Rb 的播散非常迅速，以脑转移最为常见，导致高死亡率[3]。目前，玻璃体腔化疗被认为是治疗Rb的有效方法，然而这种治疗预后极差，可能会导致肿瘤的眼外扩散[4]。因此，探索全新有效的治疗药物是必要的。桑色素是从黄桑木、桑橙树等桑科植物的树皮和许多中草药中提取的一种浅黄色色素，属于黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎和抗癌等药理作用[5]。已有研究[6]表明，桑色素能够抑制Rb 增生并促进其凋亡，提示桑色素有望成为治疗Rb 的有效药物。本文旨在研究桑色素对Rb 细胞系SO-Rb50增殖和转移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞 Rb 细胞系SO-Rb50（美国典型培养物保藏中心，WG101733）。

1.1.2 主要药物 桑色素(宝曼生物科技有限公司，D0213)；阿霉素（美国Sigma Aldrich 公司，D1515）；青-链霉素（美国GIBCO BRL 公司，15140-122）。

1.1.3 主要试剂 杜氏培养基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）、胰蛋白酶、胎牛血清、山羊血清（美国GIBCO BRL 公司，10099-141、25200-056、10099-141、16210-072）；5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine，EDU）细胞增殖检测试剂盒、Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒、BCA试剂盒、三羟基甲烷缓冲盐溶液（tris buffered saline，TBS）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（上海碧云天生物技术研究所，C0085S、C1069S、P0012、ST667-1L、A0208）；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒、聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）（南京建成生物工程研究所，I010-1-1、W003-1-1、W016-1-1）；Transwell、基质胶（美国Corning 公司，LB1126、354248）；ECL 发光液（美国Millipore 公司，WBKLS0050）；血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF，英国Abcam 公司，ab88201)。

1.1.4 主要仪器 荧光显微镜（德国徕卡公司，DM2500）；流式细胞仪（美国Fluid Imaging Technologies 公司，FlowCam CX IV）；凝胶成像系统（美国Proteinsimple 公司，FluorChem HD2）。

1.2 分组及处理

将培养的细胞分为5 组：对照组（CG）、阿霉素组（AG）、桑色素低剂量组（LCG）、桑色素中剂量组（MCG）和桑色素高剂量组（HCG）。每组设3 个复孔，将各组SO-Rb50 细胞培养于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和1×105U/L 链霉素的DMEM 培养基中，置于5%二氧化碳、37℃的恒温培养箱中培养。LCG 组、MCG 组、HCG 组每个孔分别加入桑色素200 μM、400 μM、600 μM，AG 组加入2.5 μg/mL阿霉素，CG 组加入等体积培养液。每24 h 更换新鲜培养液，选用对数生长期细胞为实验用细胞。

1.3 EDU 法检测细胞增殖

以每孔1×105/mL 将Rb 细胞接种于96 孔板，培养24 h，每个孔中加入100 μL EDU 培养基（50 μmol/L）孵育2 h，用PBS 洗涤2 次，每次5 min。将细胞进行固定和染色后，用荧光显微镜进行观测。

1.4 AnnexinV-FITC 双染法检测细胞凋亡

取各组对数生长期细胞，各组处理方法同1.2，培养24 h，胰蛋白酶消化后1,000 r/min 离心5 min，弃去上清，用PBS 重悬细胞，再次1,000 r/min 离心5 min，弃去上清液加入500 μL 的Binding Buffer 重悬细胞，之后加入5 μL Annexin V-FITC 溶液4℃下避光孵育15 min，继续加入5 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI）溶液4℃下避光孵育5 min，通过流式细胞仪上机分析各组细胞凋亡情况。

1.5 Transwell 法检测细胞侵袭

在细胞培养基中加入基质胶，再将各组细胞悬液同方法1.2 处理后加入到Transwell 的上室中，培养箱中孵育24 h，用4%多聚甲醛固定上室5 min，用棉签将上室内侧的细胞除去，室温下用0.1%结晶紫染色，10 min 后用荧光显微镜进行检测。

1.6 蛋白免疫印迹法检测ki67、Caspase-3、VEGF蛋白表达

各组处理方法同1.2，培养24 h，收集各组细胞并在冰上溶解25 min，以12,000 r/min 离心10 min，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白提取，用BCA 试剂盒测定蛋白质含量。提取等量蛋白质样品，在100℃条件下变性5 min。使用SDS-PAGE凝胶电泳法分离并转移至PVDF 膜，在4℃条件下加入相应一抗并孵育过夜，清洗，然后在4℃下加入HRP 山羊抗兔IgG，孵育2 h，最后加入ECL 发光液，曝光处理。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 18.0 进行分析，计量资料符合正态分布采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用one-way 方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 桑色素抑制SO-Rb50 细胞增殖

5 组间GEDU 阳性细胞数比较，差异有统计学意义（F=57.123，P=0.000）。组间两两比较：与CG 比较，AG、LCG、MCG、HCG 均降低，差异均有统计学意义（tAG=11.645，P=0.000；tLCG=3.307，P=0.030；tMCG=5.645，P=0.005；tHCG=8.726，P=0.001）。与AG 比较，LCG、MCG、HCG 均升高，差异均有统计学意义（tLCG=10.946，P=0.000；tMCG=11.192，P=0.000；tHCG=7.451，P=0.002）。与LCG 比较，HCG 降低，差异有统计学意义（t=6.750，P=0.003）；而MCG 无统计学意义（P＞0.05）。与MCG 比较，HCG 降低，差异有统计学意义（t=5.165，P=0.007）（图1、表1）。

图1 桑色素抑制SO-Rb50 细胞增殖图（EDU 染色法，×200）。1A 对照组；1B 阿霉素组；1C 桑色素低剂量组；1D 桑色素中剂量组；1E 桑色素高剂量组

2.2 桑色素促进SO-Rb50 细胞凋亡

5 组间细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（F=111.168，P=0.000）。与CG比较，AG、LCG、MCG、HCG 均升高，差异均有统计学意义（tAG=14.791，tLCG=16.503，tMCG=12.902，tHCG=12.566，均P=0.000）。与AG比较，LCG、MCG、HCG 均降低，差异均有统计学意义（tLCG=13.064，P=0.000；tMCG=10.087，P=0.000；tHCG=4.610，P=0.010）。与LCG 比较，MCG、HCG 均升高，差异均有统计学意义（tMCG=7.857，P=0.001；tHCG=10.197，P=0.000）。与MCG 比较，HCG 升高，差异有统计学意义（t=6.195，P=0.003）（图2、表1）。

图2 流式细胞仪检测细胞凋亡图。2A 对照组；2B 阿霉素组；2C 桑色素低剂量组；2D 桑色素中剂量组；2E 桑色素高剂量组

2.3 桑色素抑制SO-Rb50 细胞侵袭

5 组间侵袭细胞数比较，差异有统计学意义（F=81.325，P=0.000）。与CG 比较，AG、MCG、HCG 均升高，差异均有统计学意义（tAG=12.201，P=0.000；tMCG=8.241，P=0.001；tHCG=11.079，P=0.000）；而LCG 无统计学意义（P＞0.05）。与AG 比较，LCG、MCG、HCG 均降低，差异均有统计学意义（tLCG=11.770，P=0.000；tMCG=10.972，P=0.000；tHCG=5.471，P=0.005）。与LCG 比较，MCG、HCG 均升高，差异均有统计学意义（tMCG=6.509，P=0.003；tHCG=10.260，P=0.001）。与MCG 比较，HCG升高，差异有统计学意义（t=7.321，P=0.002）（图3、表1）。

表1 各组EDU 阳性细胞数、细胞凋亡率和侵袭细胞数比较（，n=3）

表1 各组EDU 阳性细胞数、细胞凋亡率和侵袭细胞数比较（，n=3）

注：* 与CG 比较，P＜0.05；# 与AG 比较，P＜0.05；△ 与LCG 比较，P＜0.05；○与MCG 比较，P＜0.05；CG 对照组；AG 阿霉素组；LCG桑色素低剂量组；MCG 桑色素中剂量组；HCG 桑色素高剂量组

图3 桑色素抑制SO-Rb50 细胞侵袭图（结晶紫染色法，×200）。3A 对照组；3B 阿霉素组；3C 桑色素低剂量组；3D 桑色素中剂量组；3E 桑色素高剂量组

2.4 桑色素升高SO-Rb50 细胞Caspase-3 并降低ki67、VEGF 蛋白表达

Caspase-3 蛋白表达：5 组间比较，差异有统计学意义（F=117.778，P=0.000）。与CG 比较，AG、LCG、MCG、HCG 均升高，差异均有统计学意义（tAG=17.579，tLCG=14.241，tMCG=16.984，tHCG=15.684，均P=0.000）。与AG 比较，LCG、MCG 均降低，差异均有统计学意义（tLCG=12.608，P=0.000；tMCG=8.056，P=0.001）；而HCG 无统计学意义（P＞0.05）。与LCG 比较，MCG、HCG 均升高，差异均有统计学意义（tMCG=7.129，P=0.002；tHCG=10.224，P=0.001）。与MCG 比较，HCG 升高，差异有统计学意义（t=5.383，P=0.006）（图4、表2）。

ki67 蛋白表达：5 组间比较，差异有统计学意义（F=124.000，P=0.000）。与CG 比较，AG、LCG、MCG、HCG 蛋白表达均降低，差异均有统计学意义（tAG=17.405，P=0.000；tLCG=6.005，P=0.004；tMCG=7.481，P=0.002；tHCG=14.003，P=0.000）。与AG 比较，LCG、MCG、HCG 均升高，差异均有统计学意义（tLCG=15.253，tMCG=14.942，tHCG=11.502，均P=0.000）。与LCG 比较，HCG降低，差异有统计学意义（t=10.136，P=0.001）；而MCG 无统计学意义（P＞0.05）。与MCG 比较，HCG 降低，差异有统计学意义（t=9.097，P=0.001）（图4、表2）。

VEGF 蛋白表达：5 组间比较，差异有统计学意义（F=114.747，P=0.000）。与CG 比较，AG、LCG、MCG、HCG 均降低，差异均有统计学意义（tAG=16.541，P=0.000；tLCG=4.203，P=0.014；tMCG=6.857，P=0.002；tHCG=12.603，P=0.000）。与AG 比较，LCG、MCG、HCG均升高，差异均有统计学意义（tLCG=17.187，tMCG=14.697，tHCG=13.693，均P=0.000）。与LCG 比较，MCG、HCG均降低，差异均有统计学意义（tMCG=3.259，P=0.031；tHCG=11.150，P=0.000）。与MCG 比较，HCG 降低，差异有统计学意义（t=7.960，P=0.001）（图4、表2）。

表2 各组Caspase-3、Ki67、VEGF 蛋白表达比较（，n=3）

表2 各组Caspase-3、Ki67、VEGF 蛋白表达比较（，n=3）

注：* 与CG 比较，P＜0.05；# 与AG 比较，P＜0.05；△与LCG 比较，P＜0.05；○ 与MCG 比较，P＜0.05；CG 对照组；AG 阿霉素组；LCG 桑色素低剂量组；MCG 桑色素中剂量组；HCG 桑色素高剂量组；Caspase-3 半胱氨酸蛋白酶-3；Ki67 增殖指数；VEGF 血管内皮生长因子

图4 蛋白免疫印迹检测Ki67、Caspase-3、VEGF 蛋白表达。CG 对照组；AG 阿霉素组；LCG 桑色素低剂量组；MCG 桑色素中剂量组；HCG 桑色素高剂量组；Ki67 增殖指数；Caspase-3 半胱氨酸蛋白酶-3；VEGF 血管内皮生长因子

3 讨论

Rb 是由Rb 基因在单个易感发展的视网膜细胞中的双等位基因突变引发[7]。Rb 在高收入国家的患者存活率大于95%，但是全球存活率小于30%[8]。目前，通过提高早期诊断，新指南和专业知识的共享，结果正在改善。动脉内和玻璃体内化疗已成为抢救眼睛的有效方法。因为活组织检查会导致转移风险，Rb 的诊断不依赖于组织病理学检查，临床上可通过观测孩子是否出现白瞳和斜视来诊断Rb。身体素质始于婴儿期，婴儿期的疾病治疗必须紧紧围绕着安全和低毒性进行。

桑色素是天然黄酮醇的成员，是一种黄色色素，从桑科的中草药中分离出来。桑色素已被证明具有许多的生物活性，包括抗氧化、细胞保护、抗突变、抗糖尿病、抗炎和抗癌作用[9]。早期的研究[10]表明，桑色素可以抑制多种肿瘤细胞的增殖，包括口腔鳞状细胞癌，白血病和结肠癌。Manna SK 等[11]研究发现，桑色素的抗肿瘤效果是通过抑制活化的NF-κB 和NF-κB 的基因表达进行调控。Lee YJ 等[12]研究发现，桑色素通过调节活性氧，Sp1 和Mcl-1 来抑制黑素瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。然而，关于桑色素对SO-Rb50 细胞生物学效应影响的研究较少，鉴于此，本研究设置不同浓度梯度桑色素干预进行研究，结果显示，与CG 比较，LCG、MCG、HCG 色素组GEDU阳性细胞数均降低，细胞凋亡率均升高，侵袭细胞数均降低，提示桑色素可以抑制SO-Rb50 细胞增殖和侵袭，促进SO-Rb50 细胞凋亡，与预期结果相符。

细胞增殖、凋亡、侵袭及转移等过程是肿瘤发生发展的重要过程。Caspase-3 属于半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶家族，在细胞凋亡进程中发挥重要作用。细胞凋亡主要包括内源性途径、外源性途径等，而Caspase 途径是两条凋亡途径的共同途径。Caspase-3 通过破坏脱氧核糖核酸酶抑制剂将其活化，进而激活其余Caspase，引发Caspase 级联反应，促进细胞凋亡[13]。Ki67 是位于细胞核内的大分子蛋白质，与细胞增殖密切相关，常用来识别正常细胞与肿瘤细胞，是细胞增殖的重要评估指标之一。有研究[14]发现，Ki67 在非小细胞肺癌细胞增殖中起介导作用，长链非编码RNA 可通过调控Ki67 表达影响细胞增殖。VEGF 是一种多生物学效应的细胞因子，广泛表达于人体各组织中，参与血管生长与成熟。在肿瘤组织中VEGF 异常表达，高表达的VEGF 可刺激肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移，促进血管形成，为肿瘤持续生长提供有利条件[15-16]。为了进一步分析桑色素抑制SO-Rb50 细胞增殖和侵袭，促进SO-Rb50细胞凋亡的机制，本研究对各组细胞Caspase-3、Ki67、VEGF 表达情况进行分析，结果显示，AG、LCG、MCG 和HCG 组Caspase-3 表达水平均高于CG 组，而Ki67、VEGF 表达水平均低于CG 组，提示桑色素抑制SO-Rb50 细胞增殖、侵袭的机制可能与降低Ki67、VEGF 表达水平有关，促进SO-Rb50 细胞凋亡机制可能与升高Caspase-3 水平有关，且具有剂量依赖性。

综上，本研究揭示了桑色素对SO-Rb50 细胞增殖和转移能力的抑制作用，并且以浓度依赖的方式促进Caspase-3 蛋白表达，抑制Ki67、VEGF 蛋白表达。桑色素作为一种中草药提取物，有望成为治疗Rb 的有效药物，但能否在临床上应用还需进一步深入研究。