不同月份纹党所含总黄酮的动态积累研究∗

靳贵林，边 洋，，3，邵士俊，杨扶德

1 西藏藏医药大学藏医药基础教育部重点实验室，西藏 拉萨 850000；2 中国科学院兰州化学物理研究所；3 甘肃中医药大学

纹党来源于桔梗科植物素花党参Codonopsis pilosula Nannf. var. modesta（Nannf.）L.T.Shen干燥根，主产于年平均气温15℃、年平均降雨量445 mm，平均海拔1500～2500 m，地处西秦岭山脉、南秦岭山带的甘肃文县中寨，质量优异远销海外。研究发现黄酮类物质具有抗癌、抗氧化、抗炎、保肝、抗血栓形成、舒张血管、抗病毒、抗菌和抗过敏等多种药理活性［1-2］。黄爱玲［3］研究发现黄酮类物质有降血脂、镇痛、增强免疫力的作用。黄酮类化合物可以有效抑制兴奋性神经递质谷氨酸释放，从而保护神经系统［4］。黄酮类化合物异甘草素通过改善脑能量代谢和抗氧化作用有效保护大脑以防脑损伤［5］。龚金炎［6］从神经递质说、神经可塑性假说和内分泌系统功能改变方面研究发现黄酮类化合物有抗抑郁症作用。现代研究［7-8］发现党参黄酮类可促进大鼠小肠上皮细胞迁移。汪建红［9］研究发现野生新疆党参总黄酮能增强小鼠血清和肝脏超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，降低丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量，延长小鼠负重游泳时间，提高肝糖原、肌糖原储备量，降低小鼠运动后血清尿素氮含量。可见，黄酮类化合物有重要的药理药效作用，而纹党品质形成研究中黄酮类化合物的研究成为不可或缺的一部分。

1 材料

1.1 仪器超声仪器（江苏昆声市超声仪器有限公司；220v、100W，Q/320583GSFY008-2006）；紫外分光光度计（perkin Elmer lambda 35）；锥形瓶（50 mL）；容量瓶（100、50、25 mL）；烧杯（50mL、100、250、500 mL）。

1.2 药材试剂纹党和白条党经甘肃中医药大学杨扶德教授鉴定为正品；乙醇（天津市凯通化学试剂有限公司，批号：20150706）；芦丁（中国食品药品检定研究院，批号：100080-201409）；亚硝酸钠（上海山浦化工有限公司，批号：20110412）；氢氧化钠（利安隆博华医药化学有限公司，批号：20100312）；硝酸铝（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20150202）。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备精密称取过40 目筛60℃下干燥2 h的纹党2.0 g置于50 mL锥形瓶中，加75%乙醇40 mL，超声提取90 min 后过滤，滤液置于50 mL 容量瓶，用75%乙醇定容于50 mL 容量瓶，即得供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备精密称取芦丁10 mg，置于250 mL 烧杯中加75%乙醇30 mL 超声使芦丁溶解，溶解液置于50 mL 容量瓶，用75%乙醇洗涤烧杯并转移洗涤液入50 mL 容量瓶，加入75%乙醇定容，即得0.2 mg/mL芦丁标准溶液（对照品溶液）。

2.3 标准曲线的制备精密取0.2 mg/mL芦丁标准溶液0.5、1、2、3、4、5 mL分别置于25 mL容量瓶，各容量瓶加入1 mL 新配5%亚硝酸钠溶液，混合均匀后静置6 min；加入1 mL 新配10%硝酸铝溶液，混合均匀后静置6 min；加入10mL 新配5%氢氧化钠溶液，摇匀后用75%乙醇定容，静置20 min。以75%乙醇为空白组，在510 nm处测定吸光度（见表1），以体积（mg/mL）为横坐标X，吸光度（A）为纵坐标Y轴，建立直线方程得Y=2.75908X-0.00602，r=0.9994，标准曲线见图1。

表1 标准曲线数值

图1 总黄酮标准曲线

2.4 精密度实验取0.2 mg/mL芦丁标准溶液2 mL加入到25 mL容量瓶中，按“1.3.3”项下“加入1 mL”起，依法测定吸光度。结果RSD值小于2%，精密度较好。见表2。

表2 精密度考察结果

2.5 稳定性实验3 支25 mL 容量瓶中分别精密加0.2 mg/mL 芦丁标准溶液1 mL，按“1.3.3”项下“加入1 mL”起，依法测定吸光度。分别于30 min及1、2、4、8、10、12 h，510 nm 处测定吸光度，通过标准曲线计算出芦丁标准溶液中含芦丁质量（mg）。结果表明0～10 h 内RSD=3.9，在0～2 h 内其值较稳定。见表3。

表3 稳定性考察结果

2.6 重复性实验精密称取过40 目筛，60℃下干燥2 h 的纹党2.0 g 置于50 mL 锥形瓶中，平行5次，按“1.3.1”项下制备，取供试品2 mL于25 mL容量瓶，按“1.3.3”项下“加入1 mL”起，依法测定吸光度，计算出供试品溶液中芦丁质量。结果表明RSD值小于2%，重现性较好。见表4。

表4 重现性考察结果

2.7 加样回收实验精密称取过40 目筛，60℃下干燥2 h 的纹党1.0 g 置于100 mL 锥形瓶中，平行5 次，按“1.3.1”项下方法制备后定容于50 mL容量瓶，为供试品溶液。5 个25 mL 容量瓶中分别加入供试品溶液2 mL，加入0.2 mg/mL芦丁标准品溶液1 mL，按“1.3.3”项下“加入1 mL”起，依法测定吸光度，计算总黄酮含量（以芦丁计）。结果显示平均回收率为96.06%，回收率较为稳定可靠。见表5。

表5 加样回收考察结果

2.8 条件优化

2.8.1 条件选择 本实验选用2015 版《中华人民共和国药典》槐花项下总黄酮测定方法，加入新配5%亚硝酸钠1 mL，混合均匀后静置6 min；加入新配10%硝酸铝1 mL，混合均匀后静置6 min；加入新配5%氢氧化钠10 mL，静置15 min，显色。超声提取总黄酮是一种高效简便不破坏化学成分的提取方法［10-12］。葛亮［13］研究发现用超声提取黄酮类化合物，以亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色测定总黄酮含量是一种简便可靠易行的方法。而黄酮类化合物回流提取时有所损失故而本实验采取超声提取方法，由于亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色较稳定可靠因而采取该显色方法测定总黄酮含量。

2.8.2 提取溶剂选择 精密称取过40 目筛，60℃下干燥2 h的纹党5份，每份2.0 g，1份加50 mL甲醇，1 份加75%乙醇50 mL，超声提取90 min，平行试验3 次，将滤液定容于50 mL 容量瓶作为供试品溶液待用。取供试品溶液2 mL 置于25 mL 容量按“1.3.3”项下“加入1 mL”起，依法测定吸光度。计算总黄酮含量（以芦丁计）。结果显示甲醇提取效率更高，选择甲醇为提取溶剂。见表6。

表6 提取溶剂考察结果

2.8.3 超声提取时间选择 精密称取6份过40目筛，60℃下干燥2 h 的11 月份纹党2.0 g 并编号，各加入75%乙醇40 mL，1 号超声30 min、2 号超声45 min、3号超声60 min、4号超声75 min、5号超声90 min、6号超声120 min，平行试验3次，滤液定容于50 mL容量瓶作为供试品溶液，待用。精密量取供试品溶液2 mL 置于25 mL 容量瓶中，按“1.3.3”项下“加入1 mL”起，依法测定吸光度。计算总黄酮含量（以芦丁计）。结果显示超声提取120 min含量最大，但75、90、120 min所含总黄酮含量做曲线可知90～120 min趋于平衡状态，综合考虑选取90 min。见表7。

表7 提取时间考察结果

2.9 供试品黄酮含量测定

2.9.1 纹党参黄酮含量测定 精密称取过40 目筛，60℃下干燥2 h的供试药材各5份，每份2.00 g，加入75%乙醇40 mL，超声提取90 min，过滤，滤液定容于50 mL 容量瓶为供试品溶液待用。精密量取供试品溶液2 mL 置于25 mL 容量瓶中，按“1.3.3”项下“加入1 mL”起，依法测定吸光度。在510 nm处测定吸光度，计算总黄酮含量。见表8。

表8 纹党总黄酮含量测定结果 mg/g

2.9.2 白条党总黄酮含量测定 精密称取过40目筛，60℃下干燥2 h 的白条党各5 份，每份2.00 g，加入75%乙醇40 mL，超声提取90 min，过滤，滤液定容于50 mL容量瓶为供试品溶液，待用。精密量取供试品溶液2 mL 置于25 mL 容量瓶中，按“1.3.3”项下“加入1 mL”起，依法测定吸光度。计算总黄酮含量（以芦丁计）。见表9。

表9 白条党总黄酮含量测定结果 mg/g

2.10 数据分析分析不同月份采收的纹党所含总黄酮与白条党参所含总黄酮；纹党在春季尚未萌发时其总黄酮含量由于尚未损耗，是全年纹党黄酮含量的最高时期，也就是说纹党总黄酮在大地解封之前含量高达2.937 mg/g；随季节变迁温度上升，5 月份纹党开始发芽破土而出，其总黄酮含量下降到1.705 mg/g；随着光合作用的加强和温度上升，纹党的生理活性在不断增强，6月份总黄酮含量较5 月份的1.705 mg/g 上升到1.950 mg/g；7～8 月份纹党生长最为旺盛，7 月份总黄酮含量达2.091 mg/g，8月份达2.001 mg/g；9月温度开始下降纹党总黄酮含量也开始下降，9 月份纹党总黄酮含量由8月份2.001 mg/g下降到1.941 mg/g，10～11月份呈整体下降趋势，11月纹党总黄酮含量降到了全年最低1.575 mg/g；12月份后大地冻结纹党采集困难。纹党全年总黄酮含量平均值为2.002 mg/g，高于白条党参（采收于9 月）的1.631 mg/g。从单一总黄酮含量讲纹党质量较好。纹党总黄酮含量全年呈现先下降后上升的趋势。见图2。

图2 纹党和白条党参总黄酮含量比较

3 小结

从纹党生长过程看，总黄酮含量出现了先下降后上升最后下降的趋势。纹党总黄酮含量7、8月最高，是纹党生长较为旺盛的季节。总黄酮含量的多少随季节变迁而变化，春季纹党尚未萌发时总黄酮含量最高，证明纹党药材“初春发芽前采收”的合理性。从黄酮含量角度分析，纹党黄酮含量高于白条党参，纹党质量较白条党好。