基于芦丁分子印迹壳聚糖-离子液体功能化石墨烯-碳纳米管的电化学传感器的制备及应用

王 苑, 赵发琼, 曾百肇*

(武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉 430072)

芦丁广泛存在于荞麦、浆果及草药中，因其具有抗氧化、抗炎、抗菌等作用而常被用于一些疾病的治疗[1]。常见的芦丁检测方法有化学发光法[2]、高效液相色谱法[3]、分光光度法[4]和毛细管电泳法[5]等。此外，由于芦丁具有良好的电活性，因此，用电化学法直接检测芦丁也有不少报道[6]。采用电化学传感器检测时，为了提高选择性常需引入分子识别元素。分子印迹聚合物(MIPs)因有良好的选择性、化学和物理稳定性等而常被用于此目的[7]。MIPs的制备方法有化学、电化学和物理方法等，其中物理方法相对较简便。物理方法印迹的单体一般为带功能基的大分子。

本工作中，我们用简单的一步水热法制备了具有3D网状结构的离子液体功能化石墨烯-碳纳米管复合材料(GN-CNTs-IL)。然后，将壳聚糖与芦丁混合，再进一步与GN-CNTs-IL混合，加戊二醛交联。以此制备分子印迹壳聚糖电化学传感器，用于芦丁的检测。结果表明，该传感器表现出良好的分析性能，而目前尚无采用该方法制备传感器的报道。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI 660D电化学工作站(上海辰华仪器公司)，实验采用三电极体系:以修饰玻碳电极(GCE，直径3 mm)为工作电极，铂丝为对电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极。Zeiss扫描电子显微镜(SEM)(英国，卡尔蔡司公司)；JEM-2100透射电子显微镜(TEM)(日本，电子株会社)；Bruker D8 X-射线衍射(XRD)仪(德国)，配Cu Kα辐射(40 kV，40 mA)。

氧化石墨烯(GO，99%)和碳纳米管(CNTs，95%)购自南京先锋纳米材料科技有限公司；芦丁购自国药集团化学试剂有限公司，壳聚糖(CS)(脱乙酰度≥95%，粘度100～200 mpa.s)和戊二醛(GA，50%)购于上海阿拉丁有限公司。0.10 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=5.5)由Na2HPO4和NaH2PO4配制。其它试剂均为分析纯，所有溶液均用超纯水配制。

1.2 GN-CNTs-IL复合材料的制备

首先，在搅拌下向35 mL GO水分散液中(0.50 mg/mL)加入21.0 mg的离子液体1-氨丙基3-甲基咪唑溴([APMIM]Br)，此时分散液产生大量絮状沉淀。接着，加入30 mg KOH，超声30 min，分散液变均一透明。然后，加入10 mg CNTs且超声混合2 h。再将上述混合液转入聚四氟乙烯反应釜中，在温度180 ℃下反应12 h。待反应釜温度降至室温后，所得产物依次用乙醇和超纯水清洗至中性，真空干燥即得GN-CNTs-IL。

1.3 分子印迹电化学传感器的制备

将10 mg CS粉末溶于5 mL 0.2%HAc溶液中，在室温下超声处理1 h制备CS溶液。取4.95 mL CS溶液和50 μL芦丁溶液(0.010 mol/L)于小烧杯中，搅拌3 h后，加入10 mg GN-CNTs-IL复合物，超声20 min。再加入5 μL交联剂GA(1%，V/V)，并在室温下继续搅拌30 min。产物冷冻干燥后配制成2.0 mg/mL的溶液，然后取6 μL分散液滴加到GCE上，自然干燥。接着，在磁力搅拌下用0.05 mol/L NaOH溶液处理电极5 min以去除芦丁分子。最后，所得电极(MIPs/GN-CNTs-IL/GCE)用超纯水洗涤，干燥备用。用相同方法制备非印迹电极，记为NIPs/GN-CNTs-IL/GCE；不加GN-CNTs-IL复合物用同样的方法制备MIPs/GCE。

1.4 电化学检测

将洗脱后的修饰电极浸入含一定浓度芦丁的0.10 mol/L PBS(pH=5.5)中，开路下富集10 min，再在0.2～0.8 V范围内进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，测量在0.5 V处出现的芦丁氧化峰。电化学阻抗(EIS)实验在含有0.10 mol/L KCl和5.0 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中进行。

1.5 样品制备

荞麦茶样品的制备参考文献方法[17]，首先用研钵将样品研成粉末，然后用乙醇超声提取粉状样品(0.100 g)，离心后将上清液置于50 mL容量瓶中，加无水乙醇定容，放在4 ℃冰箱中避光保存。复方芦丁片研碎后分散于甲醇中，超声10 min，离心后取1 mL溶液用甲醇稀释至10 mL。

2 结果与讨论

2.1 MIPs/GN-CNTs-IL/GCE的表征

不同材料的形貌和结构如图1所示。GN为表面光滑有褶皱的片层结构，引入IL后褶皱变多，层状更明显，这与IL在一定程度上可阻止GN团聚有关[18]。CNTs通过π-π相互作用进入GN片层间，使得GN-CNTs-IL呈多孔结构。经GA交联后的壳聚糖印迹膜MIPs/GN-CNTs-IL(图1D)保持了GN-CNTs-IL的多孔结构，但孔径更小更密。图1E和图1F分别是GN-IL和GN-CNTs-IL的TEM图，表明卷曲的CNTs杂乱地连接在石墨烯片层间，而IL则附着在GN褶皱上和CNTs表面。

图1 GN(A)、GN-IL(B)、GN-CNTs-IL(C)、MIPs/GN-CNTs-IL/GCE(D)的SEM图像；GN-IL(E)和GN-CNTs-IL(F)的TEM图像Fig.1 SEM images of GN(A),GN-IL(B),GN-CNTs-IL(C) and MIPs/GN-CNTs-IL/GCE(D);TEM images of GN-IL(E) and GN-CNTs-IL(F)

图2所示为制备的几种电化学传感器的EIS谱图。可见，GN-CNTs-IL/GCE的电子传递电阻很小；当有了印迹层后，阻抗较大(曲线b,900 Ω)，表明印迹层导电性较差，对[Fe(CN)6]3-/4-的电化学反应有较大阻碍作用。但当洗脱模板后，阻抗减小(曲线c，约650 Ω)，说明洗脱产生的位点可为探针提供传输通道。需要指出的是，其阻抗仍然比GN-CNTs-IL/GCE的大很多，表明NaOH溶液对芦丁有良好的溶解作用但又不破坏CS膜[19]。当把电极再次浸入到10 μmol/L芦丁的PBS中富集之后,MIPs/GN-IL-CNTs/GCE阻抗值增大至约800 Ω(曲线d)，这是由于模板分子占据了识别空腔，阻碍了[Fe(CN)6]3-/4-探针的电化学反应。这些表明，GN-CNTs-IL有良好的电子传递能力，芦丁分子被成功印迹在复合膜中。

图2 不同电极在0.10 mol/L KCl-5.0 mmol/L[Fe(CN)6]-3/-4溶液中的EIS谱图Fig.2 EIS of different electrodes in 0.10 mol/L KCl containing 5.0 mmol/L[Fe(CN)6]-3/-4(a)GN-IL-CNTs/GCE;(b)MIP/GN-IL-CNTs/GCE before elution;(c)MIP/GN-IL-CNTs/GCE after elution;(d)MIPs/GN-IL-CNTs/GCE(rebinded rutin) and (e)NIPs/GN-IL-CNTs/GCE before elution.

2.2 芦丁在不同电极上的响应

芦丁在不同电极上的DPV曲线如图3A所示。它在GN/GCE、IL/GCE和CNTs/GCE上都有比较明显的氧化峰，与GN、IL和CNTs良好的导电、催化性有关。当GN、CNTs与IL复合后，芦丁的峰电流显著增大，这是由于IL的引入不仅改善了GN、GN-CNTs在水中的分散性，而且使材料结构疏松而具有更大比表面积，从而提高了灵敏度[20]。与GN-IL/GCE相比，引入CNTs后，芦丁在GN-CNTs-IL/GCE上的峰电流进一步增大，这是因为形成了表面积更大的多孔结构。图3B是芦丁在GCE、MIPs/GCE、MIPs/GN-CNTs-IL/GCE、NIPs/GN-CNTs-IL/GCE和GN-CNTs-IL/GCE上的DPV图。在裸GCE上有一个很小的氧化还原峰，来自芦丁中酚羟基的氧化还原。在MIPs/GCE上的峰电流有所增加，但增幅较小。与NIPs/GN-CNTs-IL/GCE相比，MIPs/GN-CNTs-IL/GCE对芦丁的响应明显增强，峰电流是非印迹时的4～5倍，这是由于MIPs对芦丁分子的选择性吸附所致。芦丁在MIPs/GN-CNTs-IL/GCE上的氧化峰电流是MIPs/GCE上的5～6倍，这与GN-CNTs-IL表面积大、导电、催化性能好有关。而相同浓度的芦丁在MIPs/GN-CNTs-IL/GCE和GN-CNTs-IL/GCE上的氧化峰电流差别不大，说明芦丁印迹CS膜上的有效印迹位点多且导电性良好。

图3 (A)芦丁在IL/GCE(a)、GN/GCE(b)、CNTs/GCE(c)、GN-IL/GCE(d)和GN-IL-CNTs/GCE(e)上的DPV图；(B)芦丁在GCE(a)、MIPs/GCE(b)、NIPs/GN-IL-CNTs/GCE(c)、MIP/GN-IL-CNTs/GCE(d)和GN-IL-CNTs/GCE(e)上的DPV图Fig.3 (A) DPV of rutin at IL/GCE(a),GN/GCE(b),CNTs/GCE(c),GN-IL/GCE(d) and GN-IL-CNTs/GCE(e);(B) DPV of rutin at GCE(a),MIPs/GCE(b),NIPs/GN-IL-CNTs/GCE(c)，MIPs/GN-IL-CNTs/GCE(d) and GN-IL-CNTs/GCE(e)Supporting electrolyte:0.10 mol/L PBS(pH=5.5);accumulation time:600 s;scan rate:50 mV/s.

2.3 实验条件的优化

2.3.1 离子液体浓度的选择IL功能化对改善GN-CNTs在水中的分散性有重要作用。GO中存在大量具有活性的环氧基团[21]，在亲核试剂1-氨丙基3-甲基咪唑溴([APMIM)Br])和KOH存在的情况下，GO的环氧基可发生亲核开环反应。同时，双亲性的GO -IL可促进CNTs在水中的分散，形成分散均匀的GO -IL-CNTs混合液，在180 ℃反应釜中经12 h的高温高压水热过程后，转化为GN-CNTs-IL复合物。IL一方面增加了亲水性，另一方面引起GN层间静电排斥。实验结果表明，当IL浓度从0 mg/mL增大至0.6 mg/mL时，芦丁在所得MIPs/GN-CNTs-IL/GCE上的响应电流逐渐增大；当IL浓度超过0.6 mg/mL时，其响应电流又降低(图4A)。这是因为当IL浓度过大时，GN-CNTs分散度随之降低且不利于模板分子的洗脱。因此，实验选用0.6 mg/mL IL。

2.3.2 壳聚糖浓度选择考察了CS浓度对芦丁在MIPs/GN-CNTs-IL/GCE上的峰电流的影响。取4.95 mL不同浓度的CS溶液和50 μL芦丁溶液(0.010 mol/L)混合，当CS浓度从0.1%(V/V)逐渐增大到0.8%时，芦丁的峰电流先增加，然后下降，在0.2%时达最大值。这主要是由于高CS浓度会引起溶胀，增加膜的厚度，阻碍电子传递。但过低的CS浓度使印迹位点减少。因此，以0.2%CS用于制备印迹膜。

2.3.3 缓冲体系pH的影响缓冲体系的pH值对芦丁的电化学行为和聚合物膜的稳定性有一定影响。如图4B所示，芦丁在MIPs/GN-CNTs-IL/GCE上的峰电流随缓冲体系pH的增大先增加，然后逐渐降低。这是因为芦丁的氧化过程有质子参与[22]，pH过小或过高不利于电化学反应。另外，pH过小CS膜不太稳定。因此选用pH=5.5的PBS为支持电解质。

2.3.4 MIPs/GN-CNTs-IL滴涂量的影响随着MIP/GN-CNTs-IL(2 mg/mL)用量从4 μL增至12 μL，峰电流先增大后减小，在滴涂量为6 μL时峰电流达到最大值。这是因为起初随滴涂量增加，特异性识别位点增多；但当MIPs/GN-CNTs-IL的滴涂量过大时，有效位点数目基本不再增加，但膜厚增加阻碍电子传递，反而使响应电流变小。而当MIPs/GN-CNTs-IL的浓度大于2 mg/mL，印迹材料易发生表面脱落现象。因此，选择6 μL 2 mg/mL MIPs/GN-CNTs-IL修饰GCE。

2.3.5 芦丁与壳聚糖质量比的影响保持CS与芦丁的总质量不变，改变它们的比例，制备修饰电极(图4C)。结果表明，芦丁与CS的质量比由1∶50增加到1∶4时，所得MIPs/GN-CNTs-IL/GCE对芦丁的响应电流先增加后降低，在1∶30时达到最大值，此时对应的摩尔比约为1∶200。这无疑与印迹位点数目和膜结构变化有关。比例太高和太低时，印迹位点数目均较少，只有在合适比例时才较多。此外，比例低时复合印迹膜结构变得比较致密，不利于传质。因此，选择质量比为1∶30制备印迹电极。

图4 离子液体的浓度(A)、溶液pH(B)和芦丁与壳聚糖的质量比(C)对芦丁峰电流的影响Fig.4 Influence of IL concentration(A),solution pH(B),and mass ratio of rutin to CS (C) on peak current Solution conditions:5.0 μmol/L rutin+0.10 mol/L PBS(pH=5.5);scan rate:50 mV/s.

2.3.6 洗脱时间和吸附时间的影响考察了洗脱时间的影响，发现当洗脱时间从3 min增至11 min时，传感器对芦丁的电流响应先增加，然后略有下降。这是因为较短的洗脱时间导致洗脱不完全，而过长的洗脱时间可能会由于机械搅拌而影响MIPs稳定性，因此选择洗脱5 min。此外，还优化了富集时间。对于5.0 μmol/L芦丁，开路吸附10 min后峰电流达到最大。因此，在测量前进行10 min的富集。

2.4 芦丁的电化学检测

在上述优化条件下，记录了传感器MIPs/GN-CNTs-IL/GCE对不同浓度芦丁的DPV响应曲线(图5A)。随着芦丁浓度从0.010 μmol/L增大到200 μmol/L，峰电流先急剧增大后再相对平缓增大，分别与芦丁浓度在0.010～1.0 μmol/L和1.0～200 μmol/L两段范围内成线性关系(图5B)，线性方程分别为：IP(μA)=17.54c(μmol/L)+4.331(R2=0.9967);IP(μA)=0.1169c(μmol/L)+21.91(R2=0.9915)，检出限则达到6 nmol/L。

图5 (A)芦丁在MIPs/GN-CNTs-IL/GCE上的DPV图(芦丁浓度从a到l:0.01，0.1，0.5，0.7，1,10，50，100，150，200 μmol/L；(B)芦丁的校准曲线Fig.5 (A)DPV of rutin at MIPs/GN-CNTs-IL/GCE;(B)Calibration curve(rutin concentration(from bottom to top):from 0.010 μmol/L to 200 μmol/L)Supporting electrolyte:0.10 mol/L PBS(pH=5.5);accumulation time:600 s;scan rate:50 mV/s.

如表1所示，与其他芦丁电化学传感器相比，本研究构建的传感器具有较宽的线性范围和低的检测限。

表1 不同芦丁电化学传感器分析参数比较Table 1 Comparison of different electrochemical sensors for rutin analysis

2.5 电极的稳定性、重现性和抗干扰能力

用相同的方法制备了6支修饰电极，分别检测5.0 μmol/L芦丁，得到响应电流的相对标准偏差(RSD)为6.2%。同一支修饰电极对5.0 μmol/L芦丁重复测定5次，RSD为5.4%。将电极在室温下保存7 d后再测定芦丁，响应电流值为初始值的92.5%。说明该传感器具有良好的稳定性与重现性。

在含有5 μmol/L芦丁的PBS(pH=5.5)中，分别加入100倍的潜在干扰物，包括葡萄糖、蔗糖、多巴胺、抗坏血酸、槲皮素和柚皮素，考察它们对芦丁电化学响应的影响。实验表明这些可能的干扰物对芦丁的检测影响较小，峰电流变化范围为94.2%～107%。可见传感器具有良好的选择性。

2.6 实际样品检测

在上述优化条件下，按“1.5”处理荞麦茶和复方芦丁片样品并进行了测定。结果如表2所示，荞麦茶试液中芦丁的浓度为0.052 μmol/L，计算得荞麦茶试样中芦丁的含量为0.158 mg/g；复方芦丁片试液中芦丁浓度为0.032 μmol/L，计算得复方芦丁片中芦丁的含量为0.165 mg/g。方法的加标回收率为93.4%～102.3%，RSD为1.9%～4.6%。可见，该传感器应用于实际样品的检测有其良好的可行性。

表2 样品中芦丁的检测结果Table 2 Determination results of rutin in samples with the prepared sensor

3 结论

本研究通过将功能单体壳聚糖、模板分子芦丁与离子液体功能化的石墨烯-碳纳米管混合后，再用戊二醛交联，可制备出具有良好导电性和多孔结构的芦丁分子印迹复合材料。将该复合材料滴加在玻碳电极表面制备的芦丁分子印迹电化学传感器，在优化后的制备和测定条件下，表现出良好的分析性能。发展的方法不仅线性响应范围较宽、检出限低，而且重现性好、选择性和稳定性较高，可以用于实际样品中芦丁的检测。