碱基错配长PCR引物法检测CCNH基因rs3093816位点的多态性

常 伟，丁明翠，王 威，*

(1．平煤神马医疗集团总医院疾控中心，河南平顶山 467002；2．郑州大学公共卫生学院劳动卫生与职业病学教研室，河南 郑州 450001)

细胞周期蛋白H(cyclin H，CCNH)是细胞周期蛋白大家族的一名成员，普遍存在于真核细胞中，其基因位于染色体5q14.3。CCNH可以催化周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinases 2，CDK2)等多种CDK活化，并与周期蛋白依赖性激酶7(cyclindependent kinases 7，CDK7)共同对细胞周期和基因转录进行合理调控，从而影响细胞的增殖。CCNH可以与CDK7、辅助蛋白(menage a trois 1，MAT1)组成CDK7/CCNH/MAT1三聚体复合物[1]，即人类的细胞周期素依赖性蛋白激酶(CAK)。CAK可以使P53、RNA聚合酶2(RNA polymerase 2，RNA2)、甾体激素受体等磷酸化，从而调节转录和DNA的损伤修复，促使细胞分裂增殖，最终调控恶性肿瘤的发生与发展。从功能而言，CCNH是CAK的调节亚基，也是细胞周期调控蛋白的关键蛋白之一。细胞周期调控的异常与肿瘤的发生密切相关，有研究表明，CCNH基因rs3093816位点与口腔癌的发病密切相关[2]；也有研究发现，CCNHVal270Ala(rs2230641)与高分化甲状腺癌发病风险相关，杂合型和突变型基因型频率越高，发病风险越高[3]。越来越多的研究表明，CCNH基因多态性与非小细胞肺癌[4]、骨恶性肿瘤[5]等多种肿瘤的发生发展有关。

目前对于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)的检测有很多方法，包括动态等位基因特异性杂交(dynamic allele-specific hybridization，DASH)[6]、荧光标记探针(fluorescently labeled probes)技术[7]、和聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术(polymerase chain reaction-restrition fragment length polymorphism，PCR-RFLP)[8]等。尽管上述方法各有其自身的优势，但是由于实验方法复杂，仪器设备比较昂贵，使它们的应用受到了限制。其中，PCR-RFLP技术因其高灵敏度和可靠性而广泛应用于人类基因多态的检测。然而，PCR-RFLP技术不适合高通量筛选，目前仍面临着实用性的挑战。通过查询NEB网站(http://www.neb-china.com/)可知，CCNH基因rs3093816位点没有相应的内切酶可以识别，在本研究中，我们采用一种改进的PCR-RFLP法检测CCNH基因rs3093816位点。应用创造酶切位点(creat restriction site，CRS)原理[9]，再结合PCR-RFLP方法设计引物，选择廉价的内切酶CviQ I，对CCNH基因rs3093816位点进行了检测。同时，本研究设计了碱基错配PCR长引物和碱基错配相对短的PCR引物，比较分析碱基错配长PCR引物是否更快速经济。

1 材料与方法

1.1 研究对象

采集某企业160名职工体检的健康人群外周血，采用DNA提取试剂盒提取基因组DNA后进行CCNH基因型的检测。参与本研究的研究对象均签署了知情同意书。本研究已获得郑州大学公共卫生学院伦理委员会审批(ZZUIRB2021-80)。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 试剂DNA提取试剂盒，购于北京百泰克生物技术有限公司；1×PCR mix购于南京诺唯赞生物科技有限公司；限制性内切酶CviQI购于Thermo Scientific公司；引物和琼脂糖购于生工生物工程上海股份有限公司。

1.2.2 仪器9600型PCR仪购于PE公司；微型电泳槽购于Phamacia Biotech，EPS1000；GelDoc2000凝胶成像仪购于Bio-Rad公司。

1.3 方法原理

创造性酶切位点PCR-RFLP(creat restriction site-PCR-RFLP，CRS-PCR-RFLP)是根据引物碱基错配技术设计的检测碱基突变的方法。其原理是根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计引物，其中一条引物根据突变位点临近序列设计，人为引入错配碱基，使得引物3′端和单碱基突变的一种突变型在PCR扩增后形成一个酶切位点，然后应用相应的内切酶进行酶切鉴定。

1.4 序列查找及引物设计

在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)查找CCNH基因及其SNP信息，结合有关文献确定CCNH基因rs3093816位点碱基变异信息，利用Primer Premier 5.0软件分析内切酶识别情况，通过创造性酶切位点的方法引入新的酶切位点来识别变异。

1.4.1 序列搜索与多态位点确定结合网站信息及有关文献可确定CCNH基因rs3093816位点为C/T多态，位于第5号染色体，在基因组中的位置为87401570。

1.4.2 序列分析与引物设计经序列分析可知C/T多态没有相应的内切酶可以识别，如通过碱基错配PCR将多态位点前第3位碱基T替换为G，则该多态可由内切酶RsaI及其同工酶CviQ I识别，本研究选择较便宜的CviQ I内切酶，即C等位基因可被CviQ I内切酶及其同工酶RsaI识别并切开，而T等位基因不能被切开。

本实验根据上述分析应用CRS-PCR-RFLP原理设计引物。首先利用Primer Premier 5.0软件分析内切酶识别情况，根据序列情况确定上游引物的位置与长度，然后搜索合适的下游引物，选定引物见表1。

表1 长引物和短引物基本信息

1.5 PCR扩增及酶切鉴定

取50 ng的基因组DNA 1μL，上下游引物各0.3μL(均为0.2μmol/L)，1×PCRmix 7.5μL(包括4种dNTP混合物、Taq DNA聚合酶和镁离子)，与双蒸水组成15μL反应体系。PCR反应条件为首先94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，Tm(短引物取46℃，长引物取58℃)下退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环后72℃延伸5 min。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，用凝胶成像仪观察结果。取PCR产物10μL，加入10 U内切酶和2.5μL 10×酶切缓冲液和ddH2O组成25μL反应体系，37℃水浴中酶切过夜，电泳35 min和55 min后，用凝胶成像仪观察成像。

1.6 测序验证

PCR产物测序采用sanger双脱氧链终止法，委托生工生物工程上海股份有限公司完成。

2 结果

2.1 CCNH基因rs3093816位点多态分布与Hardy-Weinberg遗传平衡检验

经知情同意后采集某企业160名职工体检的健康人群外周血，提取基因组DNA后进行CCNH基因rs3093816位点基因型的检测。CCNH基因rs3093816位点野生型TT 59例(36.88%)，杂合型CT 76例(47.50%)，突变型CC 25例(15.63%)。该基因多态分布经Hardy-Weinberg检验，P=0.949，符合Hardy-Weinberg平衡，说明所选取的样本具有代表性。

2.2 基因型的判断

CCNH基因rs3093816位点长引物扩增后总长度为164 bp，经CviQ I酶切后可出现164、126、38 bp等3种片段(其中38 bp由于分子量较小，条带弥散，在电泳图中未显示)。酶切后基因型分别为：突变型CC为164、38 bp，杂合型CT为164、126、38 bp，野生型TT为164 bp。CCNH位点短引物扩增后总长度为259 bp，经CviQ I酶切后可出现259、240、19 bp等3种片段(其中19 bp由于分子量较小，条带弥散，在电泳图中未显示)。酶切后基因型分别为：突变型CC为240、19 bp，杂合型CT为259、240、19 bp，野生型TT为259 bp。酶切图谱见图1，表2。

表2 碱基错配长PCR引物和碱基错配相对短PCR引物法比较

图1 CCNH基因rs3093816位点PCR产物经Cvi Q I内切酶酶切后的电泳图

使用碱基错配长PCR引物和碱基错配相对短PCR引物法检测CCNH基因rs3093816位点。使用3%的琼脂糖凝胶电泳35 min后，长引物对应的扩增产物经CviQ I酶切后，3种基因型条带完全分开，清晰可分辨；短引物对应的扩增产物经CviQ I酶切后，3种基因型条带尚未完全区分开，特别是泳道4对应的杂合型基因型尚不能分辨。直到电泳时间达到55 min时，短引物对应的扩增产物经CviQ I酶切后，3种基因型条带才完全分开，清晰可分辨。

2.3 CCNH基因rs3093816位点结果鉴定

琼脂糖凝胶电泳结果发现CCNH基因rs3093816位点出现野生型TT、突变型CC和杂合型CT 3种基因型。对上述3种基因型的PCR产物进行测序鉴定，CCNH基因rs3093816位点3种类型的基因PCR产物测序结果跟预期结果完全一致。测序结果见图2。其中，方框内的字母对应多态碱基，单下划线的碱基为错配碱基，从而与前面的碱基共同形成酶切位点，与预期结果一致。

图2 CCNH基因rs3093816位点测序分析结果

3 讨论

经序列分析可知CCNH基因rs3093816位点没有相应的内切酶可以识别，本研究通过创造性酶切位点PCR-RFLP方法在CCNH基因rs3093816位点扩增产物中引入新的酶切位点，成功建立了碱基错配PCR引物法检测CCNH基因rs3093816位点。常规设计引物长度为15～30 bp，本研究设计的长引物长度为40 bp，两个片段长度差异约占总长引物长度的23%，所占比例高于短引物(8%)。据我们所知，PCR-RFLP方法中几乎没有使用过长PCR引物。本研究同时设计了碱基错配长PCR引物和碱基错配相对短PCR引物，比较分析碱基错配长PCR引物是否更快速经济。与短引物法相比，长引物占扩增总片段的比例越大，酶切产物越容易区分，凝胶电泳需要的时间越短。此外，长引物法的Tm值较高，特异性较好。

通过查询PubMed SNP数据库显示，本研究测得的正常人群的CCNH基因rs3093816位点多态性分布与在亚洲人群中分布一致。有研究显示，CCNH基因rs3093816位点与口腔癌的发病风险升高有关，且GG基因型携带者的发病风险升高两倍[10]。另有研究发现CCNH基因rs3093816位点T等位基因携带者发生肺癌的风险升高[11]。我们可以通过检测基因多态性位点筛选易感人群，因此，SNP的检测也变得越来越重要。SNP常用的检测方法有DNA测序[12]，TaqMan分析[12]，荧光标记探针技术[13]，PCR-RFLP[14]等。DNA测序是一种精确的基因分型方法，但成本较高。TaqMan探针技术最突出的优点是它不需要PCR分离或洗脱等后处理过程，从而提高检出率。但TaqMan探针荧光背景较高，且探针只有一个碱基的差异，结果容易出现假阳性；分子信标被标以不同颜色的荧光染料来实现多个SNP的同时检测。然而，适合荧光标记的染料比较少，这大大限制了检测通量[15]。

因为PCR-RFLP容易掌握，且具有较高的灵敏度和可靠性，所以在SNP检测中得到广泛的应用。本研究采用创造性酶切位点PCR-RFLP法成功建立了碱基错配长引物法检测CCNH基因rs3093816位点，PCR产物纯度比较高，酶切结果也容易分辨，通过测序验证进行验证，结果准确可靠。更加拓宽了该方法的应用范围，具有很大的灵活性和应用前景，特别适用于基层单位的检测。

综上所述，我们成功建立了碱基错配长PCR引物法检测CCNH基因rs3093816位点，此方法具备简经济快速的特点，可广泛用于大规模样本分析。