“拔伸松动法”对早中晚期膝骨性关节炎模型兔关节软骨超微结构的影响

王春林 向勇 艾健 田启东 胡鸾 赵志勇 王勇 董有康 张兴宗 赵有强

摘要：目的 觀察拔伸松动手法对膝关节骨性关节炎（KOA）早中晚期模型兔膝关节软骨超微结构的影响，探究拔伸松动法对KOA损伤软骨的治疗机制。方法 健康成年白兔90只，随机分为3组，拔伸松动法组、模型组、空白组。每组10 只。采用Videman T 造模方法，管型石膏伸直位固定兔右后肢膝关节2、4、6 周，复制膝关节骨性关节炎早期、中期和晚期的模型。采用扫描电镜、透射电镜观察软骨细胞形态。结果 模型组兔膝关节软骨细胞呈现细胞水肿，内质网溶解、线粒体固缩、细胞结构破裂、细胞固缩等改变;扫描电镜观察，模型组兔膝关节软骨出现不同程度的软骨表面不光滑、变性、破损，关节腔表面渗出物附着物等改变。经过拔伸松动法治疗干预，早中晚期拔伸松动手法组兔膝关节软骨细胞水肿程度、细胞结构破坏情况、软骨表面形态、关节腔内渗出物情况较同期模型组均有改善，且以中期、晚期改善情况明显。结论 拔伸松动手法可以延缓模型兔膝骨性关节炎所导致的关节软骨损伤，对损伤的关节软骨细胞具有修复作用。

关键词：拔伸松动法;膝关节骨性关节炎;软骨细胞超微结构

中图分类号：R244.1   文献标志码：A   文章编号：1007-2349（2022）03-0067-05

Effect of Pulling-stretching-loosening Manipulation on the Ultrastructure of Articular Cartilage in Knee Osteoarthritis Model Rabbits in Early， Middle and Late Stages

WANG Chun-lin1， XIANG Yong1， AI Jian2， TIAN Qi-dong2， HU Luan2， ZHAO Zhi-yong2，WANG Yong2， DONG You-kang1， ZHANG Xing-zong2， ZHAO You-qiang1

（1. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China;2. The First Affiliated Hospital of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650021， China）

【Abstract】Objective： To observe the effect of pulling-stretching-loosening manipulation on the ultrastructure of knee articular cartilage in knee osteoarthritis （KOA） model rabbits of early， middle and late stages and to explore the curative mechanism of pulling-stretching-loosening manipulation on KOA-damaged cartilage. Methods： 90 healthy adult white rabbits were randomly divided into 3 groups， the pulling-stretching-loosening manipulation group， the model group and the blank group， 10 rabbits per group. The Videman T modeling method was used to immobilize the knee joint of the right hind limb of the rabbit for 2， 4 and 6 weeks with cast plaster to replicate the early， middle and late stage models of knee osteoarthritis. The scanning electron microscope and transmission electron microscope were used to observe the morphology of chondrocytes. Results： The cartilage cells of the knee joint of the rabbits in the model group showed changes such as cell edema， endoplasmic reticulum dissolution， mitochondrial pyknosis， cell structure rupture and cell pyknosis. The scanning electron microscopy showed that the knee joint cartilage of the model group presented different degrees of uneven cartilage surface， degeneration， damage and exudate attachments in the joint cavity surface. After the intervention of pulling-stretching-loosening manipulation， the degree of edema， cell structure damage， cartilage surface morphology and exudate in the joint cavity of the rabbit knee joint in the early， middle and late stages of the pulling-stretching-loosening manipulation group were improved compared with the model group at the same period. The improvement was obvious in the middle and late stages. Conclusion： The pulling-stretching-loosening manipulations can delay the articular cartilage damage caused by the model rabbit knee osteoarthritis， and has a repairing effect on the damaged articular cartilage cells.

【Key words】Pulling-Stretching -Loosening Manipulation; Knee Osteoarthritis; Ultrastructure of Chondrocytes

膝关节骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种退行性骨关节疾病，其临床症状主要为膝关节疼痛，活动受限，严重影响患者生活质量。随着全球人口老龄化的进展，KOA的发病也呈上升趋势。近年来笔者采用拔伸松动法治疗KOA取得较好的临床疗效。关节软骨的退变，软骨细胞凋零是其发生过程的基本病理改变和原因[1]。本研究通过实验性兔KOA早中晚期模型，观察拔伸松动法治疗对关节软骨超微结构及软骨细胞凋亡情况的影响，探讨拔伸松动法对KOA关节软骨的保护作用和软骨细胞修复的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年白兔90只，体重（1.8～2.5）kg，雌雄不限，重量分布均一。实验动物由云南中医学院动物实验中心提供。随机分为3组，每组10只：拔伸松动法组、模型组、空白组。稳定饲养7 d后，采取Videman T的造模方法制作兔膝骨性关节炎模型。饲养于IVC动物实验室，温度20℃～25℃（日温差≤3℃）;湿度40%～70%;照明12 h∶12 h明暗交替，照度150～300 Lx;噪音≤60 dB。本次实验分3个阶段进行，采用Videman T造模方法，管型石膏伸直位固定兔右后肢膝关节2、4、6周，复制KOA早期、中期和晚期的模型。

1.2 干预方法

1.2.1 拔伸松动法组 （1）屈伸患膝关节15次。（2）拔伸法施以患膝10 s后放松，然后在拔伸下分别以小鱼际固定于膝关节下缘之内侧和外侧，向对侧推按10次（外侧向内侧，内侧向外侧）。（3）五指提拿髌骨10次，顺时针和逆时针活动髌骨10次。（4）上下左右推动髌骨各10次。（5）屈伸患膝关节15次。（6）拔伸患膝10 s，在拔伸过程中作膝关节小幅度内旋和外旋运动。每次10 min，隔日治疗1次，治疗20次后取标本。

1.2.2 模型组 造模后正常饲养，不采取干预措施，与拔伸松动法组同时取标本。

1.2.3 空白组 不予造模，正常饲养，不采取干预措施，与上2组同时取标本。

1.3 取材检测 所有动物于实验结束后1 d取材。耳缘静脉注射空气20 mL栓塞处死，切开右膝关节前中区滑膜组织，以矢状位切取胫骨内侧软骨，取出软骨组织，空置于脱酶处理的EP管内，液氮转移至-80℃冰箱保存备用。以0.1 mol二甲砷酸钠缓冲液漂洗标本，在1%四氧化锇中固定2 h后，再次以0.1 mol二甲砷酸纳缓冲液漂洗，乙醇逐级脱水后于醋酸异戊醋保存过夜，后以二氧化碳临界点干燥，将其定向黏附于载物台上，真空喷金，后通过扫描电镜进行观察。

2 实验结果

2.1 透射电镜 通过透射电镜观察关节软骨的形态变化，可以看到空白组软骨细胞未出现水肿、胞质内有丰富的内质网及高尔基体，线粒体较少，细胞核完整，胞膜结构完整（见图1.1A）。早期模型组软骨细胞出现轻度水肿，内质网部分轻度扩张，线粒体未见明显异常，胞质内有丰富高尔基体，细胞结构正常，细胞核未见异常（见图1.1B）。中期模型组软骨细胞出现轻度水肿，内质网部分少量扩张，线粒体轻度肿胀，胞质内有丰富高尔基体、微丝水肿，细胞结构完整，細胞核未见异常（见图1.1C）。晚期模型组软骨细胞出现明显水肿，内质网溶解，线粒体固缩，胞质内少见高尔基体、微丝水肿、有大量脂质溶解，细胞结构破裂，细胞固缩（见图1.1D）。早期干预组软骨细胞出现明显水肿，内质网线粒体明显减少，胞质内少见高尔基体、微丝水肿，细胞结构正常，细胞核未见明显异常（见图1.1E）。中期干预组软骨细胞出现轻度水肿，内质网、线粒体较少，胞质内少见高尔基体、微丝水肿，细胞结构正常，细胞核未见异常（见图1.1F）。晚期干预组软骨细胞出现局部轻度水肿，内质网、线粒体未见明显异常，胞质内有丰富高尔基体、微丝水肿，细胞结构正常，细胞核轻度边集（见图1.1G）。

从以上电镜观察结果可以看出，不同时间点的模型组关节软骨细胞比较空白组软骨细胞出现明显水肿，内质网出现溶解、线粒体固缩、有细胞结构破裂，细胞固缩的情况，经过一段时间的干预后，早期干预组比较模型组关节软骨无明显改善，中期干预组比较模型组有关节软骨有不同程度的改善，晚期干预组较治疗模型组关节软骨有明显改善。

2.2 扫描电镜 通过扫描电镜观察关节软骨的形态变化，可以看到，空白组关节软骨表面光滑，关节软骨结果完整，关节腔表面未见渗出物附着（见图1.2A）。早期模组关节软骨表面不光滑，软骨出现变性，关节腔表面有少量量渗出物附着（见图1.2B）。早期干预组关节软骨表面不光滑，软骨出现变性，关节腔表面有少量渗出物附着（见图1.2C）。中期模型组软骨表面不光滑，软骨出现变性，关节腔表面有大量渗出物附着（见图1.2D）。中期干预组软骨表面部分结构光滑，软骨未出现变性，关节腔表面有少量渗出物附着（见图1.2E）。晚期模型组关节软骨表面有结晶物质附着，表面结构异常、变形、破损，不光滑，关节腔表面有大量渗出物附着，红细胞出现，出现出血的情况（见图1.2F）。晚期干预组关节软骨表面结构光滑，关节腔表面有少量渗出物附着，未见红细胞出现以及出血的情况（见图1.2G）。从以上扫描电镜观察结果可以看出不同模型组关节软骨比较正常组软骨出现坏死、变性、有大量大量渗出物附着的情况，经过一段时间的干预后看出，早期干预组比较模型组关节软骨无改善，中期干预组较模型组关节软骨有不同程度的改善，晚期干预组较模型组比较关节软骨有显著的改善。

3 讨论

现代研究证实，推拿手法有助于改善关节周围的血液循环和骨内微循环，降低异常的血液黏度，降低骨内压，可促进滑液向关节软骨的浸透和扩散，改善关节软骨的营养和关节的润滑，并能减轻软骨的退变，还可增加股四头肌之肌力，改善关节的活动度[2-3]。Salter[4]经过长期的研究证实：早期持续被动运动可促进软骨的再生和修复，认为关节的反复屈伸运动可刺激软骨组织中未分化的间质细胞向软骨细胞转化，加快软骨组织的修复。

拔伸松动法是以中医推拿筋骨并重的理论为基础，在临床工作中总结创新形成的系列手法，包括对膝关节相关附属肌肉的松解，以及股胫关节、髌股关节的被动运动，体现了筋骨同治、动静结合的治疗原则。前期的临床研究证实，采用膝关节拔伸松动法治疗早中期 KOA 患者疗效确切，可有效减轻疼痛，明显改善关节活动度[5]。前期开展的基础研究证实拔伸松动法可降低 KOA 兔膝关节液中白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的水平[6-7]。

关节软骨退变是OA病理改变的主要特征，软骨细胞破坏凋亡是OA发病机制的重要环節[8]。本实验中模型组透射电镜观察见，兔膝关节软骨细胞呈现细胞水肿，内质网溶解、线粒体固缩、细胞结构破裂、细胞固缩等病理改变，扫描电镜观察见，兔膝关节软骨出现不同程度的软骨表面不光滑、变性、破损，关节腔表面渗出物附着物等改变，且上述改变呈现早期<中期<晚期，与预期表现相一致。经拔伸松动法干预后，晚期干预组透射电镜及扫描电镜观察显示关节软骨有明显改善，中期干预组透射电镜及扫描电镜观察显示关节软骨有不同程度的改善，说明拔伸松动手法具有延缓膝中期、晚期KOA模型兔关节软骨损伤，对损伤的关节软骨细胞具有修复的作用。早期模型兔软骨扫描电镜及投透射电镜观察显示损伤程度轻，但早期治疗组超微结构改变不明显，这一结果与预期不符，是干预方式的局限性还是造模方法存在问题，尚待进一步的研究证据。

参考文献：

[1]陈百成，张静.骨关节炎[M].北京：人民卫生出版社，2004：1-2.

[2]唐旭升，杜宇.手法治疗大鼠膝骨性关节炎的超微结构研究[J].中国中医骨伤科杂志，2001.9（2）：7-10.

[3]方苏亭，王胜利.松凝分筋手法治疗膝骨关节病的实验研究[J].中国中医骨伤科杂志，2001.9（2）：27-30.

[4]Salter RB.History of restand motion and the scientific basic for early continuou spassive motion[J].Hand Clincs，1996，12（1）：1-11.

[5]王春林，赵永康，赵志勇，等.拔伸松动法治疗膝关节骨性关节炎的临床观察[J].按摩与康复医学，2011，5（2）：23-25.

[6]王春林，向勇，田启东，等.拔伸松动法治疗兔膝骨性关节炎的实验研究[J].云南中医中药杂志，2010，31（9）：14-16.

[7]王春林，向勇，田启东，等.“拔伸松动法”对膝骨性关节炎兔白细胞介素1β 和肿瘤坏死因子α 的影响[J].环球中医药杂志，2014.7（2）：85-88.

[8]Goldring SR，Goldring MB.The role of cytokines in cartilage matrix degeneration in osteoarthritis[J].Clinical Orthopaedics And Related Reserch，2004（427）：27-36.

（收稿日期：2021-11-09）