1 例临床诊断为17-α 羟化酶/17，20-裂解酶缺陷症患儿及其父母和哥哥的基因检测分析

席可望，李珊，汤旭磊，傅松波，李娟，成建国

1 兰州大学第一临床医学院，兰州 730099；2 兰州大学第一医院内分泌科3 兰州大学第一医院中心实验室

先天性肾上腺皮质增生症（congenital adrenal hyperplasia，CAH）是一种较常见的常染色体隐性遗传病。患者因肾上腺皮质类固醇合成途径中的关键酶缺乏，引起皮质激素合成障碍，刺激促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）合成增多，导致肾性高血压、低血钾、性发育障碍等［1］。CAH 主要分为两大类：典型肾上腺皮质增生症和非典型肾上腺皮质增生症，前者以21-羟化酶缺陷（90%～95%）最常见，后者包括11β-羟化酶缺陷、17-α 羟化酶/17，20-裂解酶缺陷症、3β 脱氢酶缺陷、皮质酮甲基氧化酶缺陷及先天性类脂质性肾上腺增生［2］。其 中17-α 羟化 酶/17，20-裂解酶缺陷症（17α-hydroxylase/17，20-lyase deficiency，17OHD）较为罕见，约占CAH 的1%［2］。细胞色素P450c17 酶（Cytochrome P450c17 enzyme，CYP17A1）基因突变可导致类固醇激素缺乏，导致糖皮质激素和性激素减少，但因中间产物去氧皮质酮（Desoxycorticosterone，DOC）累积代偿皮质醇不足，患者出生后的一段时间并无特殊临床表现，导致17OHD早期很难确诊，且部分患者无阳性家族遗传史。基因缺陷筛查可有助于明确疾病诊断，指导临床制定合理的方案，提高患者生存质量［3］。目前临床关于17OHD的诊断及治疗方法相关报道较少。我们收治了1例疑似17OHD的患儿，检测患儿及其家系的基因情况，了解17-α羟化酶/17，20-裂解酶缺陷症患儿的基因变异及遗传情况，为本病的诊断及治疗方案的制定提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 患儿，3 岁，女性外貌，因“性特征异常3个月余”于2020年11月12日就诊我院，以“两性畸形”收住入院。患儿父母于入院前3 个月发现患儿下腹部椭圆形包块，伴反复多次嵌顿，无恶心、呕吐，无腹痛、腹胀、腹泻。于当地医院就诊，当地医院行“剖腹探查术”，术中发现双侧鞘突均未闭合，双侧“子宫圆韧带”近内环口约1 cm 处分别可见约1 cm 直径肿物，质中，进一步行“腹腔镜探查+双侧腹股沟区肿物切除活检+双侧腹股沟斜疝疝囊高位结扎术”，术后患儿恢复良好。双侧腹股沟肿物病理检查显示：纤维组织内可见较多小管状结构，形态学似曲细精管，呈结节状排列，周围可见大量后壁血管，病理诊断为：两性畸形？。染色体检查结果显示，患儿染色体核型为“46，XY”。当地医院诊断为双侧腹股沟斜疝、两性畸形。为进一步诊治转至我院。患儿发病以来精神食欲良好，既往体健否认高血压史。父母体健，非近亲结婚，无相关遗传病家族史。入院体格检查：血压：111/55 mmHg，全身肤色略深，双侧乳腺未发育，青春期发育Tanner分期Ⅰ期，外阴口呈幼女型，无阴毛，外阴无色素沉着，可见阴道口。生长发育评估：身高105 cm，体质量17.5 kg，均处于生长曲线第97百分位数，智力发育在正常范围内。辅助检查结果为电解质：血钾4.01 mmol/L，血钠141 mmol/L，血氯109 mmol/L，血钙2.4 mmol/L，无机磷1.71 mmol/L，血镁0.79 mmol/L。激素检测结果为：血清类胰岛素生长因子-1（IGF-1）99.7 ng/mL、胰岛素样生长因子结合蛋白-3（IGFBP3）4.64 μg/mL、4pM 皮质醇（Cor）1.16 μg/mL、8AM 促肾上腺皮质激素（ACTH）分别为44.6 ng/mL、黄体生成素（LH）0.42 mIU/mL、卵泡刺激素（FSH）27.92 mIU/mL、雌二醇（E2）＜10.00 pg/mL、脱氢表雄酮（DHEA）＜15.0 μg/dL、孕酮（P）1.7ng/mL、睾酮（TT）1.37 ng/mL、泌乳素（PRL）15.2 ng/mL，雄烯二酮（A4）＜0.300 ng/mL、尿游离皮质醇（UFC）21.56 μg/24 h、24 h 尿17 羟类固醇（17-OHCS）1.83 mg/24 h、24 h 尿17-酮类固醇（17-KS）0.39 mg/24 h、17α 羟孕酮（17α-OHP）0.07 ng/mL、肾素（Renin）＜0.50 ng/L、醛固酮（ALD）85.01 ng/L。左侧手部X 线骨龄评估：骨龄与实际年龄大致相符；双侧肾上腺彩超：双侧肾上腺未见明显异常；妇科B超检查未探及子宫及双侧卵巢。

1.2 患儿及其家系全基因组检测 ①提取外周血基因组DNA：签署知情同意书后，抽取患儿、哥哥及其父母外周血各8 mL，以EDTA K2抗凝，将外周血送上海瀚垚生物医学科技有限公司。采用TIANamp Micro DNA 提取试剂盒（DP316，天根生化科技有限公司，中国）根据标准程序操作提取患儿及其他家庭成员基因组DNA。②PCR 扩增基因组DNA：通过降解、环化将DNA 转化为单链环状DNA 后对其进行末端修复，PCR 扩增构建DNA 文库。DNA 文库与捕获的Capture Library 杂交，使用Dynabeads®MyoneTMStreptavidin T1 捕获杂交DNA，同时用PCR 扩增捕获文库，并使用Q-PCR 文库进行质检。③基因组DNA 测序分析：将DNA 文库上样到流动槽然后置于测序仪中，使用Illumina 测序仪器进行测序。Illumina测序仪器使用检测拷贝数芯片，可检测出染色体非整倍体以及100 kb以上基因组拷贝变异［4］。运用BWA 软件比对到参考基因组上（hg19 版本），对测序深度、均一性、探针特异性等数据进行统计分析。用GATK 软件对这个样本的比对数据进行多态性位点的检测，对单核苷酸多态性（single nucleotidepolymorphisms，SNPs）和插入缺失突变（InDels）等数据进行统计和分析，查找SNPs 及InDels 在千人基因组、ESP6500si、ExAC_ALL、Ex-AC_EAS及迈基诺内部1000正常汉族人群数据库频率，利用SIFT、PolyPhen2、MutationTaster、GERP++等数据库对SNPs及InDels 的致病性进行预测分析，筛选千人基因组、ESP6500si、ExAC_ALL、Ex-AC_EAS及迈基诺内部1000正常汉族人群数据库中频率＜0.05 且预测结果均为致病性的位点作为疾病相关位点。

2 结果

患儿10 号染色体CYP17A1 基因第6 外显子存在c.987delC 纯合错义突变（p.Tyr329fs），即CYP17A1 基因第987 位缺失C，导致氨基酸合成时329 位酪氨酸移码突变。见图1。患儿哥哥和父母都存在c.987delC 杂合错义突变（p.Tyr329fs），见图2～4。患儿家系突变分析表明患儿携带的CYP17A1基因突变分别来源于父母，见图5。

图1 患儿10号染色体CYP17A1基因第6外显c.987delC基因突变情况

图2 患儿父亲10号染色体CYP17A1基因第6外显c.987delC基因突变情况

图3 患儿母亲10号染色体CYP17A1基因第6外显c.987delC基因突变情况

图4 患儿哥哥10号染色体CYP17A1基因第6外显c.987delC基因突变情况

图5 17 OHD患儿的遗传家系图

3 讨论

17OHD 的发病率为1∶50 000～100 000［5］。17OHD是由于CYP17A1基因突变引起，该基因主要在肾上腺和性腺中表达，定位于10q24.32，包含8个外显子和7 个内含子，基因全长6.6 kb，其编码的细胞色素P450催化许多药物代谢以及胆固醇、类固醇和其他脂类合成，是激素合成途径中产生黄体酮、盐皮质激素、糖皮质激素、雄激素和雌激素的关键酶［6-7］。CYP17A1 基因变异类型较多，人类基因突变数据库中已报道100 多例，包括错义突变、无义突变、缺失突变、插入突变、剪接突变等［8-9］。迄今为止，外显子6 的P.H373L、P.Y329fs 突变和外显子8的D487_F489 突变是中国人CYP17A1 基因最常见的突变，该突变在日本、泰国、韩国等亚洲国家均有报道，可能是一种亚洲人群的“祖先效应”，即不同的种族CYP17A1 基因突变不同［9～12］。本例患儿检测到10 号染色体CYP17A1 基因第6 外显子存在c.987delC 纯合错义突变p.Tyr329fs，分别来自父亲和母亲的杂合基因突变，为中国人群CYP17A1 基因常见突变类型。

CYP17A1 基因调控17-α 羟化酶/17，20-裂解酶合成，这种酶在类固醇激素的合成中起到以下两种作用：①17-羟基化反应可催化孕烯酮醇和孕酮羟化，若此酶缺乏可导致DOC、皮质酮和18-羟皮质酮生成增加，上述激素具有盐皮质激素和糖皮质激素样作用，可代偿患者皮质醇不足，患者出生后无肾上腺皮质不足表现，但过度代偿时，盐皮质激素样作用导致患者出现低肾素性高血压，低血钾表现。②17，20-裂解反应可催化17 羟孕烯酮醇和17 羟孕酮裂解，最终生成性激素，该酶缺乏导致性激素合成不足，引起性腺幼稚、第二性征缺如等［13］。本例患儿表现为低肾素、皮质醇、17-羟孕酮、UFC、DHEA、TT、E2 和A4，高FSH，ALD 正常。17-OHCS 和17-KS 降低提示患者肾上腺皮质功能处于较低状态，患儿ALD 正常可能因为送检标本中含有醛固酮前体皮质酮，另一种可能是患者体内残存17OHD，这与SUN 等［14］报道的醛固酮正常患者相似。MACKENZIE 等［15］认为CYP17A1基因可能通过共同的调节因子影响醛固酮水平，YAMAKITA 等［16］认为醛固酮水平与基因受损程度相关［15-16］。另外，通过文献检索未发现LH 降低的患者，因此需根据患儿的年龄和性别判断LH水平。

17OHD 典型临床表现为低肾素性高血压，低钾血症，男性假两性畸形和女性性幼稚，雄激素水平低，黄体生成素、卵泡刺激素增高［17］。CYP17A1 基因的缺陷可分为完全性联合缺陷型17OHD、部分性联合缺陷型17OHD（非经典型）和孤立性17，20-碳链裂解酶缺陷症（isolated 17，20-lyase deficiency，ILD），部分性联合缺陷型17OHD 患者17-α 羟化酶/17，20-裂解酶缺乏程度轻于完全性联合缺陷型17OHD 患者，因此前者临床症状也较后者轻［18］。完全性联合缺陷型17OHD 患者最常见，46，XX 患者表现为第二性征不发育、原发闭经、幼稚子宫等，46，XY 患者表现为假两性畸形、外生殖器女性化、腹腔或腹股沟区睾丸、子宫和卵巢缺如。完全性联合缺陷型17OHD 患者均有高血压、低血钾等典型临床表现，但有研究表明，10%～15%患者可表现为血压正常［9，19-20］。部分性联合缺陷型17OHD 患者因有少量性激素产生，因此46，XX 患者常表现为月经稀发、经期不规律、继发性闭经、不同程度乳腺发育和阴毛生长，46，XY 患者表现为不完全男性化、阴毛稀少、假两性畸形［21-22］。ILD 患者保留17-α 羟化酶活性，但17，20-裂解酶活性缺乏，因此表现为尿道下裂、小阴茎、阴囊对裂，血压、血钾正常［23］。综上所述，本例患儿的临床表现提示患儿属于完全性联合缺陷型17OHD。患儿最初被误诊为“双侧腹股沟斜疝”，这是由于46，XY 型患者胚胎期分泌苗勒管激素，导致副中肾管退化，出生后内生殖器男性化，但睾丸常位于腹腔或腹股沟，外生殖器女性化，但阴道常为盲短［24］。基于此，患儿一般诊断较早。患儿其他临床表型如外生殖器女性化、无子宫、无输卵管等，均符合17OHD 临床表现［25］。本例患儿并未出现高血压和低血钾，生长发育处于正常水平，且未见肾上腺增生，与一例韩国病例报道［20］中患儿仅表现为血压、血钾正常一致。

目前各种精确的分子遗传学检测已被用于17OHD 的诊断，大多数患者在青春期被确诊，部分轻中度表型通常在中老年被确诊。其中二代测序技术（next generation sequencing，NGS）的使用，使得大量的单基因和多基因遗传性疾病明确诊断。NGS技术具有高通量、速度快、精度高、信息量丰富等优势，是目前17OHD 最主要的诊断技术之一。但不同的测序方法在基因检测数目、数据分析速度、检测成本等方面有很大的差异，因此合适的检测方法不仅为临床医师迅速诊断提供遗传学依据的同时还可以降低患者诊治成本。

17OHD 的治疗主要以糖皮质激素替代治疗以及对症治疗为主。糖皮质激素主要作用是抑制ACTH，改善雄激素水平，降低DOC 水平。糖皮质激素替代治疗可选择地塞米松、泼尼松和氢化可的松，其中氢化可的松属于生理性糖皮质激素，具有一定水钠潴留作用（盐皮质激素样作用），因此临床应用更广泛［26-29］。为了患儿心理健康应尽早确认性别，早期药物治疗可改变性激素水平。我们给予患儿醋酸泼尼松2.5 mg/晚口服，使患儿获得正常青春期发育。但人工激素无法替代生理性脉冲分泌及昼夜节律，因此定期随访和检查激素变化对17OHD 患儿的预后至关重要。3 个月治疗后患儿血清8AM 的ACTH 43.9 ng/mL、4pM 的ACTH 65.1 ng/mL、LH1.2mIU/mL、FSH 35.9 mIU/mL、E2＜5.00 pg/mL、TT＜2.5 ng/mL、PRL 24.9 ng/mL，提示患儿仍存在低皮质醇、低性腺激素、高促性腺激素，调整为醋酸泼尼松5 mg/口服，将继续对患儿进行随访。此外研究［30］发现，46，XY 患者常在腹腔或腹股沟区发现发育异常的异位睾丸，极易发生恶变，因此需要手术切除异位睾丸。本例患儿于外院误诊为“双侧腹股沟斜疝”，双侧异位睾丸已行手术切除，同时我们建议患儿父母针对患儿外生殖器假两性畸形可考虑手术矫正。

综上所述，17OHD 患儿存在10 号染色体CYP17A1 基因第6 外显子c.987delC（p.Tyr329fs）纯合突变，其父母、哥哥均为10 号染色体CYP17A1基因第6 外显子c.987delC（p.Tyr329fs）杂合突变。17OHD 患儿的外显子突变来自父母遗传。17OHD是一类较为罕见的CAH 典型表现为低肾素性高血压、低钾血症、性腺功能异常等，部分患者临床表现不典型易造成误诊、漏诊，临床诊疗过程中应从临床表现、辅助检查及基因检测等方面综合诊断。