槲皮素预处理高糖环境培养的人脐静脉内皮细胞氧化应激、内质网应激反应观察

江颖娟，蒋作锋，岑俊林，李桂东，余慧文

广州市红十字会医院暨南大学医学院附属广州红十字会医院全科医学科，广州510220

糖尿病的发病率逐渐升高，糖尿病及其慢性并发症可严重降低患者生活质量，增加经济负担［1］。大血管的动脉粥样硬化是导致糖尿病患者致残乃至病死的主要原因之一。氧化应激反应和内质网应激反应在动脉粥样硬化病变进程可能发挥重要作用。由于氧化应激反应可导致糖尿病患者组织中ROS过量产生，促进内皮细胞凋亡，最终导致动脉粥样硬化的发生发展。持续的高血糖状态还可触发患者体内的内质网应激反应，激活分子伴侣糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78），启动内皮细胞的凋亡程序［2］，导致动脉粥样硬化的发生发展。最新研究［3］发现，高血糖状态下人体内皮细胞的氧化应激反应、内质网应激反应可互相促进，进一步诱导内皮细胞的凋亡，促进动脉粥样硬化的发生、发展。深入研究靶向氧化应激、内质网应激的作用机制可能为为糖尿病并发动脉粥样硬化的防治提供新思路。中药具有稳定性好、不良反应轻、疗效明确等优点，中药用于治疗慢性病的基础研究是目前的研究热点之一。槲皮素是一种具有很多种生物学活性的天然黄酮类物质，具有促进氧自由基清除、抵抗脂质过氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理学作用［4］。近期有研究［5］指出，槲皮素可抑制病毒感染导致的心肌细胞凋亡，其作用机制可能与其抑制内质网的应激有关。有研究［6］指出，槲皮素可通过抑制内质网应激，抑制视网膜细胞、神经元细胞的损伤。槲皮素是否通过抑制氧化应激及内质网应激反应保护内皮细胞，抑制动脉粥样硬化的发生发展，目前尚不清楚。自2020 年3 月起，我们观察了不同剂量槲皮素预处理后采用高糖培养液培养的内皮细胞活性、氧化应激及内质网应激情况，旨在为研究槲皮素治疗糖尿病并发症动脉粥样硬化的作用机制提供理论基础。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器 人脐静脉内皮细胞购买自上海艾研科技有限公司。槲皮素单体、DMEM 低糖培养基、CCK-8 细胞活性检测试剂盒自Sigma 公司；PBS 粉、胰酶、胎牛血清等购自美国Hyclone 公司。蛋白提取试剂盒购自Bioworld 公司。抗C/EBP同源蛋白（CHOP）抗体、抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12（Capsae12）抗体、GRP78抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗购自Zenbio 公司。LDH 检测试剂盒、ROS 检测试剂盒购自南京建成生物。凋亡检测试剂盒Annexin V-FITC/PI 购自南京凯基生物公司。细胞培养瓶、各种离心管和不同型号的细胞培养板等购自美国Corning公司［7］。

1.2 内皮细胞分组及槲皮素处理方法 在37 ℃、含CO2为5%的细胞培养箱中采用培养内皮细胞，实验前换成无血清培养基培养12 h，然后按照分组情况处理细胞。将内皮细胞分为槲皮素组（Q20 组、Q50 组、Q100 组）、高糖组（HG 组）及正常对照组（Control组），Q20组预先加入20 μmol/L的槲皮素预处理1 h，再加入10 mg/L的葡萄糖培养细胞，Q50组预先加入50 μmol/L 的槲皮素预处理1 h，再加入10 mg/L 的葡萄糖培养细胞，Q100 组预先加入100 μmol/L 的槲皮素预处理1 h，再加入10 mg/L 的葡萄糖培养细胞。HG 组在培养液中加入10 mg/L的HG 培养细胞，Control 组采用低糖DMEM 培养基培养。

1.3 各组内皮细胞活性观察

1.3.1 各组细胞活性测算 取各组细胞接种于96孔板，调整细胞密度5×107/L。培养24 h时按照说明书向每孔细胞加入CCK-8 溶液，在37 ℃下培养箱继续培养2 h。采用酶标仪检测各组光密度（450 nm波长）OD 值，并计算各组细胞活性。细胞活性（%）=［药物组OD 值－空白对照孔OD 值］÷［正常组OD值－空白对照孔OD值］×100%。各组实验至少重复3次，取平均值。

1.3.2 各组细胞凋亡情况观察 采用流式细胞术。培养24 h 时收集细胞，调整细胞浓度为5×105/mL，预冷PBS 洗涤细胞2 次，按照说明重悬细胞于Binding Buffer 中，分别向每管细胞内加入10 μL Annexin V和10 μL PI试剂，室温避光放置10 min，加入Binding Buffer，流式细胞仪测算各组细胞凋亡率。实验至少重复3次，取平均值。

1.4 各组内皮细胞氧化应激情况观察

1.4.1 各组细胞活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）检测 采用流式细胞术。取对数生长期各组细胞接种于6孔板，贴壁生长培养至80%左右，每孔分别加入终浓度为20 μmol/L 的DCFH-DA，37 ℃培养箱继续培养30 min，PBS 洗涤内皮细胞，胰酶消化细胞，最含3%FBS 的PBS 悬浮细胞，采用流式细胞仪检测各组细胞ROS。用平均荧光强度（median fluorescent intensity，MFI）代表ROS 含量。各组重复3次，取平均值。

1.4.2 各组细胞培养液中LDH 活性检测 培养24 h 时取各组细胞培养液，3 000 r/min 离心10 min，采用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒测定内皮细胞细胞培养液中LDH活性。各组重复不少于3次，取平均值。

1.5 各组细胞内皮细胞内质网应激情况观察 采用Western Blotting 法检测各组内皮细胞GRP78、CHOP 和Caspase12。培养24 h 时取各组细胞，按照蛋白提取试剂盒说明书提取核蛋白，测定蛋白浓度并调整蛋白至合适浓度，取30 μg 蛋白上样，进行SDS-PAGE 分离，将蛋白转印至硝酸纤维素膜，采用脱脂牛奶持续封闭4 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗继续室温孵育1 h，TBST 清洗后用Odyssey 凝胶成像系统扫描成像，所得结果以GAPDH 为内参［7］。各组重复3次，取平均值。

1.8 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件进行统计数据处理。采用Kolmogorov-Smirnov test 检验是否符合正态分布，成正态分布的计量资料以表示，各组间比较采用单因素方差分析One-way ANOVA。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组内皮细胞活性比较 培养24 h 时Control组、Q20 组、Q50 组、Q100 组、HG 组及内皮细胞活性分别为100%、88.50% ± 4.01%、90.93% ± 2.83%、92.525±2.46%、80.56%±3.36%、，与Control 组比较，HG 组内皮细胞活性下降（P＜0.01）；与HG 组比较，Q20组、Q50组、Q100组内皮细胞活性增加，且随浓度增加，细胞活性上升（P均＜0.01）。

2.2 各组细胞凋亡率比较 培养24 h 时Q20 组、Q50 组、Q100 组、HG 组及Control 组细胞凋亡率分别为19.20% ± 1.78%、14.56% ± 1.47%、9.00% ±3.12%、23.46% ±1.80%、3.47% ±0.96%。与Control 组比较，HG 组细胞凋亡率增加（P＜0.01）；与HG组比较，Q20 组、Q50 组及Q100 组细胞凋亡率降低，且随槲皮素浓度增加，细胞凋亡率下降（P均＜0.01）。

2.3 各组细胞ROS 含量比较 培养24 h 时Q20组、Q50 组、Q100 组、HG 组及Control 组细胞ROS 含量分别为215.67 ± 4.51、185.33 ± 17.79、144.00 ±9.17、233.67 ± 8.50、119.66 ± 5.86。与Control 组比较，HG 组细胞ROS 含量升高（P＜0.05）；与HG 组比较，Q20 组、Q50 组及Q100 组细胞ROS 含量降低，且随槲皮素浓度增加，ROS含量降低（P均＜0.01）。

2.4 各组细胞培养液中LDH 活性比较 培养24 h时Q20 组、Q50 组、Q100 组、HG 组及Control 组细胞培养液中LDH活性分别为（152.33 ± 11.02）、（129.00 ± 13.00）、（116.67 ± 19.01）、（160.00 ±13.11）、（98.67±7.02）U/L。与Control 组比较，HG组细胞培养液中LDH 活性升高（P＜0.05）；与HG 组比较，Q50组及Q100组细胞培养液中LDH 活性降低（P均＜0.05）；与Q50 组比较，Q100 组细胞培养液中LDH活性降低（P均＜0.05）。

2.5 各组细胞GRP78、CHOP 和Caspase12 表达量比较 培养24 h 时各组细胞GRP78、CHOP 和Caspase12表达量比较见表1。

表1 培养24 h时各组细胞GRP78、CHOP和Caspase12表达量比较（）

表1 培养24 h时各组细胞GRP78、CHOP和Caspase12表达量比较（）

注：与Control组比较，＊P＜0.05；与HG 组比较，＃P＜0.05；与Q20组比较，＆P＜0.05；与Q50组比较，ΔP＜0.05。

3 讨论

长期的高血糖状态是导致糖尿病患者并发心脑血管疾病的主要原因。血糖水平的高低与颈动脉内膜中层厚度呈正相关，也是亚临床动脉粥样硬化的指标之一［8］。同时还有研究表明，高血糖可促进单核细胞和内皮细胞粘附，诱发出一系列氧化应激反应、炎症反应等，最终导致内皮功能障碍和动脉粥样硬化的发生。因此应该及早干预并严格控制糖尿病患者的血糖水平，减少内皮细胞的损伤和动脉粥样硬化的发生。

槲皮素属于黄酮类化合物的一种，分布广泛，存在于洋葱、浆果、甘蓝、苹果以及茶和红酒中，以往的研究表明槲皮素具有一定的抗炎、抗肿瘤、抗氧化应激等作用［9］，但其对高糖损伤的内皮细胞是否具有保护作用目前研究较少。本研究中结果显示高糖诱导下内皮细胞的细胞活性较Control 组明显下降，同时细胞膜损伤程度和细胞凋亡较Control 组明显升高，说明高糖对内皮细胞具有一定的损伤作用，这一结果与其他课题组的研究结果具有一致性［10］；同时本研究证实槲皮素可改善高糖条件下内皮细胞的细胞活性、细胞膜损伤，减少细胞凋亡，初步表明槲皮素对内皮细胞具有一定的保护作用，但其是否与氧化应激和内质网应激相关仍需要进一步研究。

目前长期的高血糖状态导致动脉粥样硬化的发病机理尚不清楚，高糖条件下内皮细胞内产生的的ROS 与机体内抗氧化防御系统不平衡，过量生成的ROS引起内皮细胞的损伤，增加了内皮细胞凋亡，最终导致动脉粥样硬化的发生［11］。研究［12］报道，槲皮素通过减少角膜上皮细胞ROS 的生成发挥保护角膜保护作用。还有研究［13］指出槲皮素通过拮抗氧化酶的作用抑制H2O2诱导的嗜铬细氧化损伤。以上这些研究表明槲皮素可通过对氧化的抑制发挥细胞保护作用，但槲皮素对高糖条件下内皮细胞的氧化应激的研究较少，本研究采用高糖条件下的内皮细胞为研究对象，结果发现，与Control 组相比，高糖明显促进了内皮细胞ROS 的表达，这与以往的研究结果是一致的［14］，同时本研究还发现槲皮素可明显减少高糖培养条件下内皮细胞ROS 的生成，这一结果初步表明槲皮素可能通过抑制氧化应激反应改善高糖培养条件下内皮细胞的活性，减少内皮细胞凋亡，当然这一过程还有可能有其他机制的参与。

内质网是负责蛋白质折叠、转录后修饰和转运的细胞器，对维持细胞的稳态具有非常重要作用，各种生理和病理因素都可以引起内质网内错误折叠或未折叠蛋白的积累，即形成内质网应激。目前发现内质网应激参与了人类很多常见疾病的发生、发展。现有已经发现了三种内质网应激的相关蛋白，分别是肌醇需求因子1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）、活化转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6）、类蛋白激酶内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK），它们负责激活了内质网应激的三条信号通路［15］。正常情况下三者与分子伴侣GRP78 相结合，当内质网应激发生时，GRP78与IRE1、ATF6 以及PERK 分离，并进一步激活下游的相关凋亡信号［16］。近年来大量研究［17-18］表明，糖尿病患者动脉粥样硬化与内质网应激反应相关，持续高血糖状态可通过诱导炎症因子及内质网应激标志分子表达，导致内皮细胞凋亡［19］。糖尿病、肥胖和代谢综合征患者的GRP78、CHOP 以及凋亡信号分子Caspase12 等的水平可能是提示动脉粥样硬化和心血管疾病的重要标志［20］。糖尿病持续的高血糖状态诱发的氧化应激反应和内质网应激相互促进，进一步促进了内皮细胞的凋亡，最终导致动脉粥样硬化的发生。槲皮素可通过抑制内质网应激相关蛋白PERK、IPE1、CHOP 的表达以及JNK 的磷酸化减少不对称二甲基精氨酸处理下肾小球内皮细胞的凋亡［21］；槲皮素还可通过抑制GRP78、CHOP的表达抑制多巴胺能神经元内质网应激的发生，减少细胞凋亡［22］。因此槲皮素在一定的条件下可以抑制某些细胞的内质网应激反应，但槲皮素是否抑制高糖条件下内皮细胞的内质网应激反应，目前报道较少。本研究发现高糖可以引起内皮细胞内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP 以及Caspase12 的表达增加，并促进内皮细胞的凋亡，而槲皮素则可明显减少高糖条件下内皮细胞GRP78、CHOP 以及caspase12 蛋白的表达，减少内皮细胞的凋亡，这些结果提示槲皮素可能通过抑制高糖引发的内皮细胞内质网应激，进而抑制内皮细胞凋亡，发挥内皮细胞的保护作用。

综上所述，槲皮素预处理可能提高槲皮素能增强高糖培养液中的内皮细胞活力，降低细胞培养液中LDH 活性，抑制细胞凋亡，降低ROS 含量，抑制细胞GRP78、CHOP 及Caspase 12 表达，且呈一定剂量依赖性。槲皮素在高糖条件下可能通过抑制内皮细胞的氧化应激和内质网应激反应，抑制内皮细胞的凋亡。槲皮素对高糖诱导的内皮细胞有一定程度的保护作用，其作用机制可能与抑制高糖引发的氧化应激和内质网应激相关。