QuEChERS-SPE-UPLCMS/MS法快速测定水产品中氯霉素

许晓辉

兰州市食品药品检验检测研究院

吴兴强

中国检验检疫科学研究院

张虹艳

兰州市食品药品检验检测研究院

李晨曦

兰州市食品药品检验检测研究院

潘秀丽

兰州市食品药品检验检测研究院

王小乔＊

兰州市食品药品检验检测研究院

氯霉素对多种病原菌有较强的抑制作用，可用于动物各类传染性疾病的治疗，曾在水产养殖业中得到广泛应用，但同时也带来了水产品中氯霉素残留的严重问题。氯霉素存在严重的毒副作用，能抑制人体骨髓造血功能，引起人类的再生障碍性贫血，白细胞减少和粒细胞缺乏，新生儿、早产儿灰婴综合征等，低浓度的药物残留还会诱发致病菌的耐药性，因此水产品中残留的氯霉素对人类健康构成了巨大威胁[1-3]。我国禁止在水产品养殖过程中使用氯霉素，2019年农业农村部发布了食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单，规定在食品动物中不得检出氯霉素[4]。目前我国国家标准《可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱-串联质谱法》（GB/T 20756-2006）和《动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》（GB/T 22338-2008）是水产品中氯霉素残留检测的主要标准[5-6]，然而，上述标准前处理方法繁琐，费时费力，难以适应水产品中氯霉素高通量快速筛查。因此，本研究将操作步骤进行优化，采取QuEChERS-固相萃取-液质联用法测定水产品中的氯霉素，该法可提高分析效率，并且能够达到规定的准确性和重现性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-质谱联用仪6460：配有电喷雾离子源及MassHunter数据处理系统（美国安捷伦公司）；分析天平：感量0.1 mg和0.01 g（瑞士梅特勒-托利多公司）；超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；容量瓶（天津市天玻玻璃仪器有限公司）；真空泵（天津市津腾实验设备有限公司）；涡旋混合器（美国Scientific公司）；离心机（德国Eppendorf公司）；移液器：20 μl、100 μl、1 ml（德国Eppendorf公司）；甲酸、乙酸铵（色谱纯，东京化成工业株式会社）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；超纯水（美国Millipore公司）；丙酮（分析纯，白银良友化学试剂有限公司）；正己烷（色谱纯，德国Merck公司）；LC-Si小柱（500 mg/3 ml，美国Supelco公司）； NaCl（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）; Na2SO4（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

对照品氯霉素（批号：G129945，纯度：99.2%）、氯霉素-D5（批号：H409107AL，纯 度：100.0%）购 自Dr.Ehrenstorfer GmbH，样品为市场购买的鱼肉及购买于中国检验检疫科学研究院的氯霉素鱼肉质控样品。

1.2 色谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18柱（2.7μm，3.0×100 mm）；柱温：35℃，进样量：2μl，流速：0.4 ml/min。流动相A为含5 mmol/L乙酸铵的水溶液，流动相B为乙腈，流动相的比例为体积百分比，梯度洗脱程序如表1所示。

表1 梯度洗脱程序

1.3 质谱条件

离子源：负离子电喷雾电离模式；监测模式：多反应监测模式（MRM）；喷雾电压：500 V；雾化气：N2；气流温度：325 ℃；干燥气流速：8 L/min；鞘气流速：12 L/min；鞘气温度：350 ℃；毛细管电压：3500 V；MRM模式定性定量分析氯霉素的离子对、碎裂电压、碰撞能量等见表2。

1.4 溶液的制备

1.4.1 对照品溶液制备

氯霉素标准储备溶液：精密称取氯霉素对照品11.66 mg，置于10 ml棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为 1.157 mg/ml的储备液，置 4 ℃冷藏备用。氯霉素标准中间溶液：准确移取上述标准储备溶液1 ml至100 ml棕色容量瓶中，用乙腈稀释定容至刻度，配制成质量浓度为 11.57 μg/ml的混合标准中间液，置 4 ℃冷藏备用。氯霉素标准使用溶液：准确吸取上述标准中间溶液0.25 ml置于50 ml棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为 57.85 ng/ml的使用溶液，置 4 ℃冷藏备用。

氯霉素-D5内标储备溶液：准确移取浓度为100μg/ml氯霉素-D5对照品1 ml，置于10 ml棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成质量浓度均为10μg/ml的储备液，置 4 ℃冷藏备用。氯霉素-D5内标使用溶液：准确吸取上述内标储备溶液0.5 ml置于10 ml棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为 500 ng/ml的使用溶液，置 4 ℃冷藏备用。

1.4.2 供试品溶液制备

提取：准确称取样品5 g于50 ml离心管中，加入氯霉素-D5内标使用溶液50 μl，再加入3 ml EDTA缓冲液和陶瓷均质子，涡旋1 min，准确加入10 ml乙腈，涡旋1 min，超声提取5 min，加入1 g NaCl和4g Na2SO4，充分涡旋2 min，5000 r/min离心10 min，取上清液待净化。

净化：用5 ml丙酮-正己烷（1+9，体积比）淋洗LC-Si小柱，弃去淋洗液，精密移取1.00 ml上述上清液到LC-Si小柱，弃去流出液，用5 ml丙酮-正己烷（6+4，体积比）洗脱，收集洗脱液于平行蒸发仪试管中，40 ℃蒸发至干，用1 ml乙腈-水（2+8，体积比）定容，定溶液过0.22μm滤膜至进样瓶中，上液质联用仪测定。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件优化

鱼肉样品中蛋白质和脂类含量高，是提取净化过程中的主要干扰组分，因此必须采取适宜的提取净化方法去除干扰组分，而氯霉素易溶于甲醇、乙腈、丙酮。因此，本研究采用QuEChERS盐包法提取被测化合物，样品中加3 ml EDTA缓冲液进行活化，选择乙腈作为提取溶剂，NaCl和Na2SO4作为盐析剂与脱水剂，一方面促进盐析，另一方面促使水相和有机相分层。经过以上步骤粗去除蛋白质、脂溶性成份及其他成份，然后以正相萃取柱LC-Si小柱净化粗提取溶液，被分析物氯霉素不被吸附先流出，要除杂的杂质则被吸附在硅胶上，此提取净化过程简单、便捷。

2.2 色谱-质谱条件优化

色谱条件的选择与优化：氯霉素为极性化合物，液相色谱检测极性化合物时，分离常用的色谱柱有C18，本研究采用适合极性化合物分离的Poroshell 120 EC-C18色谱柱，选择流速为0.4 ml/min，使柱压达到适宜的数值，有利于提升化合物的分离和改善峰型。流动相的选择与优化：本研究采用负离子扫描模式，故在水相中加适量的乙酸铵以提高离子化效率，采用含5 mmol/L乙酸铵的水溶液和乙腈为流动相。

质谱条件的优化：不接色谱柱，用二通阀代替色谱柱，将氯霉素与氯霉素-D5储备液稀释至适宜浓度，分别上机进样分析。在负离子检测模式下进行全扫描，得到分析离子质量数，其次对准分子离子进行选择离子扫描，优化毛细管出口电压，得到最佳碎裂电压，接着使用优化好的碎裂电压对准分子离子进行子离子扫描，得到碎片离子信息，根据得到碎片离子的丰度选择被测化合物的定性和定量离子对，最后进行多重反应监测扫描，使用优化好的碎裂电压及确定的定性定量离子对，优化定性定量离子对的最佳碰撞能量。然后，把质谱与液相色谱连接，确定氯霉素出峰位置后进行电喷雾电压、离子源温度、辅助气流速、雾化气等优化，使氯霉素分子离子与碎片离子的离子强度达到最佳，最终确定为本研究的质谱条件。

2.3 方法学考察

取空白样品鱼肉按照“1.4.2”方法制成空白样品基质溶液，用上述空白样品基质溶液配制标准曲线点，在最佳色谱-质谱条件下测定，以氯霉素的定量离子的峰面积为纵坐标（Y），对应质量浓度的标准曲线点溶液为横坐标（X）绘制标准曲线，内标法定量。结果表明，氯霉素在0.2893 ～11.57 ng/ml范围内线性关系良好，相关系数（r2）大于0.99详见表3。

表3 氯霉素的标准曲线及相关系数

取阴性鱼肉样品，标准使用溶液通过最小添加量，按照“1.4.2”方法同法处理后上机进样，以3 倍信噪比计算氯霉素的检测限（limit of detection,LOD）。向阴性样品中添加低、中、高三个水平的标准使用溶液，每个添加水平平行制备3份样品，按照“1.4.2”进行前处理，上机测试，每份样品重复测定3次，做加标回收实验。取同一质量浓度的标准使用溶液连续进样6次，测定氯霉素峰响应值的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD )（%），计 算精密度。结果显示，检测限为0.1μg/kg，3个添加水平的平均回收率在100.7%～114.5%之间，精密度为1.65%，详见表4。

表4 氯霉素的检测限、平均回收率及相对标准偏差（n=3）

2.4 实际样品测定

将氯霉素鱼肉质控样按“1.4.2”方法前处理后，上机测试，内标法定量，测得浓度与标示浓度值一致，得到MRM离子流图如图1所示。

图1 氯霉素鱼肉质控样MRM离子流图

3 结论

水产品中氯霉素的检测，蛋白质及脂肪的去除是整个分析过程中的关键点。本研究建立了QuEChERS-SPE-UPLCMS/MS测定水产品中氯霉素的分析方法，并将该方法应用于实际样品的检测。通过对水产品样品盐包粗去除蛋白及脂肪等杂质，再经LC-Si小柱细净化去除提取液中残存的杂质，净化后的样品溶液在0℃静置，均无脂类析出，保持澄清透明，且回收率高。说明本法操作简便、净化效果好，能够有效消除样品中基质影响，极大提高检测的准确度、灵敏度、重现性，并可有效降低假阳性检测结果的出现概率，可为市场监管部门快速高效筛查水产品中氯霉素提供技术支撑。

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