基于网络药理学和分子对接技术探讨四妙勇安汤治疗冠心病的分子机制

叶招娣，周绍唐，徐 璐，刘中勇

心血管疾病(CVD)给社会带来巨大的经济负担，动脉粥样硬化是导致心血管疾病的主要原因，导致人群的高死亡率[1]。2017年的心脏病大会指出，冠心病的患病率呈攀升态势，缺血性心脏病的患病率从2003年的0.46%提高到2015年的1.02%，增加了2倍多[2]。现有研究发现动脉粥样斑块中存在大量的炎性细胞浸润[3]，而很多医家认为机体的炎症反应与中医热毒有相似之处，邪毒入络，脉络瘀阻，气血运行不畅，郁而化热，热而伤阴，阴损及阳，丛生变证[4]。四妙勇安汤具有清热解毒的功效，可治疗热毒脱疽，越来越多的研究表明，四妙勇安汤能够抑制炎症反应从而起到抗动脉粥样硬化的作用。基于系统生物学理论的网络药理学可以更为系统地探究中药复方的活性成分和作用靶点，指导基础研究以及中药新药的研发。

1 资料与方法

1.1 四妙勇安汤相关靶点筛选 通过检索中药系统药理学技术平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)并下载中药化学成分，根据口服生物利用度(OB)≥30%且类药性(DL)≥0.18的2个ADME属性值进行活性成分初步筛选以获得活性化合物及其作用的蛋白质靶点，并根据已发表的文献报道补充未预测到的活性化合物的已知靶点。筛选结束后，为标准化蛋白质靶点信息，统一在UniProt蛋白质数据库(https://www.uniprot.org)将化合物作用的蛋白质靶点进行规范。

1.2 冠心病相关靶点筛选 冠心病相关靶点筛选以“cardiovascular disease”“coronary heart disease”“coronary artery disease”为关键词在OMIM(http://www.omim.org/)数据库和GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库进行筛选，合并疾病数据库靶点后，删除重复值得到冠心病的疾病靶点。在GeneCards数据库中，Score值越高则代表该靶点与疾病联系密切，若靶点过多则设定Score大于中位数的目标靶点为冠心病的潜在靶点[5]。

1.3 四妙勇安汤成分-冠心病靶点网络图 为探讨四妙勇安汤药物相关靶点与冠心病靶点间的相互作用，将得到的药物有效成分及靶点与疾病的靶点进行合并，得到四妙勇安汤有效成分治疗冠心病的靶点。将得到的靶点数据上传至 Cytoscape 3.7.2软件中，构建“药物-成分-靶点”网络图。其中节点代表金银花、玄参、当归、甘草有效成分和靶点等，边代表四味中药成分与成分、成分与靶点之间、药物与成分靶点之间的关系。

1.4 药物-疾病核心蛋白相互作用(PPI)网络构建 将药物和疾病的交集靶点数据输入至STRING数据库(http：//string-db.org)中，将物种定义为“人”，构建四妙勇安汤治疗冠心病的PPI网络。将STRING数据库文件导入至Cytoscape 3.7.2软件中，并运用其内置工具分析有效成分及靶点的网络拓扑参数，包括连接度(Degree)、介度(Betweenness)及紧密度(Closenesss)等，以Degree值大于平均值为标准，筛选出核心靶点[6]。

1.5 功能富集与生物通路分析 将药物和疾病的交集靶点数据传输至DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库中，选择“OFFICE_GENE_SYMBOL”“genelist”，种属选为“Homosapiens”，之后选取“gene ontology”下的“GOTERM_BP_DIRECT”以及“pathways”下的“KEGG_PATHWAY”进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析以及基因本体(gene ontology，GO)生物过程的富集分析。

1.6 分子对接验证 从RSCB数据库(http://www．rcsb.org/)中下载白细胞介素6(IL6)和血管内皮生长因子(VEGF)的晶体结构，采用AutoDock Tools 1.5.6 软件删除IL6和VEGF复合物中水分子，分离配体和受体，添加非极性氢，计算Gasteiger 电荷，保存为pdbqt文件。从pubchem 下载小分子3D 坐标文件，在pymol 中检查空间结构无误后，利用openbabel 转换为pdb 格式，将结构件载入AutoDock Tools 1.5.6 程序，添加原子电荷，分配原子类型，所有柔性键均默认可旋转，保存为pdbqt 格式，作为对接配体。以IL6和VEGF作为受体，以中药候选成分作为配体，根据靶蛋白复合物中配体的坐标确定分子对接的活性位点，根据IL6和VEGF蛋白活性口袋设置Gridbox 坐标及大小，采用AutoDock Vina 进行分子对接，对对接结果进行分析处理。

2 结 果

2.1 四妙勇安汤活性成分的筛选 通过TCMSP数据库检索金银花、玄参、当归、甘草的有效成分，并与文献中检索得到的有效成分一同纳入，初步提取出金银花化学成分236种、玄参化学成分47种、当归化学成分125种、甘草化学成分280种，经ADME筛选后共获得金银花23种、玄参9种、当归2种、甘草93种，共127种化学成分，按OB值的大小列举出了30个，包括哈帕苷(harpagoside)、胺(inermine)、丁子香萜(mairin)、甘草酚(glycyrol)，详见表1。金银花成分作用靶点395个、玄参成分作用靶点95个、当归成分作用靶点92个、甘草成分作用靶点1 893个，合并后删除重复值共得到靶点137个。

表1 四妙勇安汤的药物活性成分

2.2 四妙勇安汤治疗冠心病潜在作用靶点 将收集到的金银花、玄参、当归、甘草靶点删除重复值后，得到四味药有效成分作用靶点137个，冠心病靶点3 177个，将药物与疾病的靶点合集得到药物与疾病的Venn图。获得药物与疾病的共有靶点为116个，即为四妙勇安汤治疗冠心病的潜在靶点。详见图1。

图1 药物与疾病靶点合集的Venn图

2.3 药物-成分-靶点网络图 治疗冠心病的“药物-成分-靶点”网络图见图2，图中左上方圆圈代表药物的作用靶点，右下方长方框代表药物的活性成分，Degree值大于80的标记为红色，代表此节点更重要，图中共有262个节点，其中药物4个，药物治疗疾病的活性成分121个，药物的作用靶点137个，通过Cytoscape 3.7.1内置的Network Analyzer分析四妙勇安汤治疗冠心病的核心成分，按Degree值进行排序：槲皮素(介度为0.260 949 55，紧密度为0.522 357 721 69，连接度为169)、β-谷甾醇(介度0.088 000 00，紧密度0.467 000 000 00，连接度为150)、山奈酚(介度为0.083 000 00，紧密度0.462 000 000 00，连接度105)，预测槲皮素、β-谷甾醇和山奈酚为四妙勇安汤治疗冠心病的主要活性成分。

图2 四妙勇安汤治疗冠心病的药物活性成分靶点图

2.4 药物-疾病的核心靶点PPI网络图 将药物金银花、玄参、当归、甘草与冠心病的靶点合并取交集，得到药物治疗疾病的116个靶点，将116个靶点导入STRING数据库，物种限定为“人”，得到药物-疾病PPI网络图，图中共有116个节点、1 239条边，平均连接度值为21.4，设置中将网络中断开连接的节点隐藏，详见图3，节点代表靶标蛋白，边表示蛋白与蛋白之间的关系。再将该结果以TSV格式导出，导入到Cytoscape 3.7.2软件中，以Degree值大于平均值22为标准进行筛选，最终得到43个核心靶点，详见图4。其中颜色字体越大代表节点值较高的靶点，其中IL6、肿瘤坏死因子(TNF)和血管内皮生长因子A (VEGFA)可能是四妙勇安汤治疗冠心病的主要靶点，TP53基因、表皮生长因子(EGF)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK8)、禽肉瘤病毒17的转化基因(JUN)、过氧化氢酶(CAT)、环氧化酶2(PTGS2)等亦为重要的靶点。

图3 四妙勇安汤-冠心病靶点PPI网络图

图4 四妙勇安汤-冠心病核心靶点PPI网络图

2.5 GO生物过程分析 将药物治疗疾病的116个靶点录入DAVID数据库并进行GO分析，得到分子功能(MF)、生物过程(BP)和细胞成分(CC)条目，再根据P≤0.05、错误发现率(FDR)≤0.05进行筛选，得到GO-BP 47条、GO-CC 11条、GO-MF 12条。并通过在线网址omicsshare(http://omicsmart.com/)对数据进行可视化。由结果可见，多个靶点的功能与冠心病的发生发展密不可分。四妙勇安汤主要参与的生物学过程包括对药物反应、对缺氧的反应、对一氧化氮生物合成过程的正向调控和调节老化等；相关靶点治疗冠心病的功能主要富集在与转录因子结合、活化蛋白质异源二聚体、与同一蛋白、血红素结合等。详见图5～图7。

图5 四妙勇安汤-疾病交集的靶点GO-BP富集分析

图6 四妙勇安汤-疾病交集的靶点GO-CC富集分析

图7 四妙勇安汤-疾病交集的靶点GO-MF富集分析

2.6 KEGG通路富集分析 将药物作用与疾病的靶点录入DAVID数据库，得到KEGG通路73条，以P≤0.05以及FDR≤0.05为筛选标准，筛选出了17条，包括癌症通路(pathways in cancer)、TNF信号通路和低氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路。详见表2。

表2 四妙勇安汤治疗冠心病靶点通路富集结果

2.7 四妙勇安汤中核心活性化合物作用于IL6和VEGFA的分子对接结果 结合能小于0说明化合物与蛋白可以自发结合，使用autodock vina所做的对接，结合能在-5～-10 kJ/mol表明结合效果比较好[7]，化合物与蛋白结合的构象稳定时能量越低，发生的作用可能性越大。分子对接结果显示，将四妙勇安汤在药物化合物-靶点网络中按Degree值选取13个核心活性化合物与IL6、VEGFA进行分子对接，与IL6结合能最低的化合物分别为豆甾醇(结合能为-7.5 kJ/mol)、木犀草素(结合能为-7.0 kJ/mol)和异鼠李素(结合能为-7.0 kJ/mol)。与VEGFA结合能最低的化合物分别为豆甾醇(结合能为-8.3 kJ/mol)、shinpterocarpin(结合能为-7.7 kJ/mol)、β-谷甾醇(结合能为-7.6 kJ/mol)和licoagrocarpin(结合能为-7.6 kJ/mol)。由结合能可见四妙勇敢汤药物核心成分与靶分子结构稳定，结合活性较高。选取结合能较优的10个核心化合物进行展示(见表3)，分别展示了结合能最优的豆甾醇与IL6和VEGFA的3D效果(见图8、图9)。

表3 四妙勇安汤中结合能较优的10个核心化合物作用于IL6和VEGFA 单位： kJ/mol

图8 豆甾醇与IL6的3D互作蛋白

图9 豆甾醇与VEGFA的3D互作蛋白

3 讨 论

冠心病是严重威胁人类健康的心脏疾病，现代医学为防治冠心病制定了诸多策略，但治疗过程中仍有胃肠道不适、重要脏器出血等不良反应，中医通过辨证治疗冠心病往往能取得良好的效果。临床工作中发现，四妙勇安汤加味治疗稳定型心绞痛疗效确切，并能改善病人的临床症状和血脂水平[8]。实验研究发现，四妙勇安汤能不同程度地降低白细胞介素1(IL1)、TNF-α和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)水平的作用以及减少斑块区NF-κBp65亚基表达[9]。

冠心病的主要病因是动脉粥样斑块形成，炎症反应介导了动脉粥样硬化形成的不同阶段，从最初的白细胞募集到不稳定动脉粥样硬化斑块的最终破裂，一些炎症级联标志物[如P-选择素、IL6、TNF-α、可溶性细胞间黏附分子-1和C-反应蛋白(CRP)]已经被证明可以预测斑块破裂的风险[10]。现代医学的炎症反应与中医的热毒有相似之处，且冠状动脉粥样硬化性心脏病与脱疽均属于血管病变，而四妙勇安汤为治疗热毒脱疽的千古名方，根据“异病同治”的治疗原则，推测四妙勇安汤能够治疗冠心病，并在临床治疗中取得良好疗效[11]。

本研究通过网络药理学方法初步筛选出四妙勇安汤治疗冠心病的活性成分为槲皮素、β-谷甾醇和山奈酚。槲皮素是天然的抗氧化剂之一，动脉粥样硬化形成过程中低密度脂蛋白通过受损的内皮进入管壁内膜，氧化修饰成低密度脂蛋白胆固醇，研究发现槲皮素可以在体外抑制低密度脂蛋白氧化从而防治动脉粥样硬化[12]。植物甾醇β-谷甾醇可与胆固醇竞争肠道内胆盐胶束内的空间，从而减少胆固醇的吸收[13]，一项荟萃分析显示，每天摄入2.15 g的甾醇可使低密度脂蛋白胆固醇降低8.8%[14]。山奈酚是一种天然的类黄酮，存在于多种植物中，研究发现，山奈酚对心脏具有保护作用，通过多种途径实现，如抑制炎性因子TNF、 IL1、IL6和NF-κB的激活而发挥抗炎作用[15]；抑制凝血酶和纤维蛋白聚合物的形成而发挥抗血小板作用[16]；提高超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽-S-转移酶的浓度而起到抗氧化作用[17]。分子对接结果显示，四妙勇安汤中豆甾醇、木犀草素和异鼠李素等与靶点VEGFA和IL6具有一定的亲和力，故推测四妙勇安汤主要通过豆甾醇、木犀草素和异鼠李素来治疗冠心病。

本研究通过网络药理学方法发现，四妙勇安汤治疗冠心病的靶点主要是IL6、TNF和VEGFA。动脉粥样斑块的形成，巨噬细胞吞噬低密度脂蛋白后变成泡沫细胞，释放大量的细胞因子，如IL6、TNF，这些炎性因子会促进斑块的不稳定和导致内皮功能障碍[18]。VEGFA促进动脉粥样斑块内不成熟的病理性新生血管生成，动脉粥样硬化形成过程中释放的炎症细胞、脂质会通过这些新生血管渗漏出来，加重炎症反应。此外，不稳定的病理性新生血管一旦破裂会导致出血，加重管腔狭窄，增加心脑血管疾病急性发作的风险[19]。

四妙勇安汤治疗冠心病的通路包括TNF信号途通路、HIF-1信号通路和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路。TNF作为一种重要的细胞因子，与其受体(TNFR1、TNFR2)结合，可以诱导细胞凋亡、细胞存活、炎症和免疫等多种细胞内信号途径[20]。动脉粥样硬化时，氧气无法弥散至内膜下组织而造成缺氧，缺氧可诱导HIF-1的激活，HIF-1α可以诱导VEGF的转录，促进血管生成，血管生成进一步导致斑块体积增大和斑块内出血，造成斑块的不稳定[21]。PI3K可诱导下游的AKT与细胞膜相结合，并使AKT发生磷酸化，AKT激活可在体内保护心功能，防止短暂性心肌缺血损伤，缩小梗死面积[22]。由此推测四妙勇安汤主要是通过抑制TNF、HIF-1信号通路以及PI3K/AKT途径来防治冠心病。

综上所述，本研究显示金银花-玄参-当归-甘草共有121个活性成分，作用于137个靶点，经过多种蛋白功能，涉及多种通路和生物进程，进一步体现四妙勇安汤多成分、多靶点、多途径治疗冠心病的特点，后续可以此为基础进行实验验证，进一步确认四妙勇安汤治疗冠心病的作用靶点和信号通路。