肌萎缩侧索硬化相关标志物及发病机制的研究进展

司马旦旦，潘卫东，桂丽卿，郑煊璐

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一种致命的进行性成人运动神经元疾病，病程进展迅速，病人多在发病后数年内因进行性呼吸肌麻痹死亡。从1993年第1次证实超氧化物歧化酶1(SOD1)为ALS的相关基因至今，目前已发现超过30个ALS相关基因。然而，超过90%的ALS病人为散发性，并不携带ALS相关基因。分析ALS密切相关标志物对明确ALS发病机制及开发ALS潜在治疗药物均具有重要意义[1]，故本研究对ALS相关标志物的研究进行综述。

1 ALS的可能致病机制

RNA依赖腺嘌呤脱氨酶(ADAR) N端有2个或3个将腺苷(A)转化为肌苷(I)的双链RNA(dsRNA)结合域。目前在哺乳动物中，已确定3个结构相关的ADAR家族成员(ADAR1、ADAR2和ADAR3)。其中，ADAR2的下降是散发性ALS病人运动神经元的一个特征，其可能导致RNA GluA2 Q/R位点编辑的失败、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体对Ca2+的通透性改变，从而导致运动神经元的凋亡。

大多数散发性ALS 病人运动神经元存在ADAR2的下降和mRNA GluA2 Q/R位点A～I转换的失败，其中ADAR2催化GluA2 Q/R位点的RNA编辑，运动神经元中ADAR2的缺乏可能引起GluA2 Q/R位点编辑缺失[2]。

在散发性ALS病人的尸检中发现，其GluA2 mRNA在Q/R位点的编辑较正常人减少[3]。动物实验表明，ADAR2条件性敲除小鼠表现出运动功能的进行性下降和运动神经元的进行性凋亡。而在没有ADAR2缺陷的情况下，当小鼠的GluA2 Q/R位点正常编辑，ADAR2缺陷运动神经元的凋亡得到了缓解。该研究提示，ADAR2的缺失和GluA2 Q/R位点的失编辑与运动神经元凋亡相关[4]。

1.1 AMPA受体GluA2 Q/R部位的编辑与AMPA受体的Ca2+通透性 AMPA受体是离子型谷氨酸受体的一个亚型，由4个同型或异型的四聚体GluA亚基(GluA1到GluA4)组成。研究证实，AMPA受体所介导的运动神经元的凋亡可能存在两种机制：AMPA受体GluA2 Q/R部位未编辑的增加和编辑的相对减少，最终引起AMPA受体Ca2+通透性的改变，导致细胞凋亡[3-7]。

GluA1到GluA4在Q/R位点均存在1个CAG序列(Q的密码子)，但仅有GluA2在Q/R位点有R的密码子。在ADAR2的催化下，RNA在GluA2 Q/R位点进行A-to-I的编辑：CAG序列(Q的密码子)在 pre-mRNA作用下转化为CIG，CIG在翻译过程中被读作CGG(R的密码子)，大量携带正电荷的R残基可阻止Ca2+通过AMPA受体，使AMPA受体对Ca2+不通透[2]。故AMPA受体的Ca2+通透性可能由GluA2亚基的存在或缺失决定，当AMPA受体由GluA1、GluA3或GluA4亚基组成而GluA2缺失时，其对Ca2+通透；当AMPA受体包含GluA2亚基时，Ca2+不能通过的AMPA受体。

GluR3亚基对Ca2+通透，当GluR3增加时GluA2相对减少，Ca2+通透的AMPA受体比例随之上升。变异的SOD1 Tg小鼠运动神经元中GluA3增加，对其使用GluR3反义RNA后，其生存年限较前增加，提示运动神经元的凋亡可能由于非GluA2的AMPA受体比例增加所导致[7-8]。东京大学研究小组的ALS小鼠模型研究中同样存在GluA3的上升，在持续脊髓蛛网膜下隙给药过程中，给药2周以后开始出现GluA3 mRNA表达量的上升，4～8周开始缓慢发生运动神经元的选择性变性脱落，在此过程中GluA3以外的AMAP受体的亚基表达无变化，这一变化在使用AMPA受体拮抗剂后可以被阻止[5，9]。脊髓运动神经元的GluA2 mRNA少于其他神经元，故GluA3增加引起的GluA2比例变化更易对运动神经元产生影响。然而条件性敲除小鼠的GluA2时，并未观察到运动神经元的凋亡[9]，提示AMPA受体的改变可能仅是运动神经元凋亡的不利因素。

1.2 AMPA受体对Ca2+的通透所导致的核-质转运的中断 运动神经元病中可能存在Ca2+失调引起的核质转运功能障碍。在Akamatsu等[10-11]的研究中，当ADAR2缺陷小鼠运动神经元的AMPA受体对Ca2+通透时，钙蛋白酶被错误定位于细胞核，并裂解核孔蛋白(nucleoporins，Nups)。当神经元核孔复合物(nuclear pore complex，NPC，包括核层和Nups)被蛋白酶降解时，过量的Ca2+流入细胞核，破坏正常的核-质转运。同时由于核膜对Ca2+的通透，核质中Ca2+水平出现变化，并影响了基因的表达。该研究证明，运动神经元病病人的运动神经元中可能存在一种钙蛋白酶介导的病理机制。ADAR2的逐步下降是散发性ALS病人运动神经元的一个特征，但导致细胞凋亡的下游事件可能是Ca2+的过量内流。其可能导致钙蛋白酶的错误激活，并降解包括反式激活应答DNA结合蛋白43(transactivation response DNA-binding protein 43，TDP-43)和Nups在内的生理功能分子。

散发性ALS病人和ADAR2缺陷小鼠的运动神经元中均有发现被钙蛋白酶降解的Nups和其他核-质转运元件，证明ADAR2下降的下游，存在因RNA代谢失调导致的细胞核重要的生理蛋白功能的改变，影响正常的核-质转运，从而间接影响基因表达，最终导致运动神经元的凋亡[10]。

1.3 病理性TDP-43在ALS中的致病机制 TDP-43是一种核蛋白，由 414 个氨基酸构成，生理状态下仅在核内发挥作用，参与转录调控和选择性剪接。因1号常染色体的TARDBP(transactive response DNA-binding protein gene)基因编码被命名为TDP-43。多数ALS病人皮质和脊髓中存在高度磷酸化的病理性TDP-43聚集体[12]。

正常情况下，TDP-43蛋白多分布在核内，仅少量分布在胞质。TDP-43的异常和错误定位是较为公认的散发性ALS病人和部分家族性ALS病人的病理指标。其中，TDP-43病理包括TDP-43从细胞核向细胞质的错误定位、异常胞质包涵体的形成，和异常病理组织中异常碎片化和磷酸化[13-14]。此外，病理性TDP-43并不局限于ALS运动神经元，阿尔茨海默病、创伤性脑损伤、海马硬化症、路易体痴呆等的神经系统疾病中也能观察到这种现象。

研究表明，ARDR2缺陷小鼠表现出TDP-43从细胞核到细胞质的错误定位，类似于ADAR2缺陷运动神经元的病理性TDP-43。通过蛋白免疫印迹法(Western Blot)证明，TDP-43特异性地被一种Ca2+依赖性半胱氨酸蛋白酶切割后的TDP-43片段与AR2小鼠运动神经元组织中的TDP-43片段呈现出相似的分子带[8，10]。提示TDP-43的错误定位可能是钙蛋白酶错误定位于细胞核的下游事件。由于GluA2 Q/R位点RNA的编辑失败，Ca2+通过AMPA受体过量流入核内，激活的钙蛋白酶和由此产生的TDP-43碎片在胞质中聚集形成包涵体，导致TDP-43从细胞核向细胞质的错误定位和异常胞质包涵体的形成[15-16]。

病理性TDP-43作为散发性ALS的病理诊断标志被逐渐认可，然而病理性TDP-43仅是运动神经元病病人ADAR2下降导致运动神经元凋亡的下游事件或在运动神经元病的病理机制中发挥作用，现在仍未完全明晰。目前存在两种假设，即功能获得假设和功能缺失假设：病理性TPD的错误定位和异常包涵体的形成可能通过细胞毒性作用诱发了运动神经元的凋亡；或TDP-43的错误定位使核内原有的部分功能缺失，最终导致神经元的凋亡。

生理状态下，TDP-43存在于核内，参与RNA的代谢过程[15]。当TDP-43错误定位于核外时，TDP-43的功能缺失，动力蛋白激活蛋白1(Dynactin1)水平降低，自噬体-溶酶体的融合被抑制，不成熟的自噬囊泡积累，自噬过程收到抑制[17]，异常聚集的TDP-43蛋白降解减少并在胞质中积累形成异常包涵体。TDP-43同时具有剪切调节作用，TDP-43与囊性纤维化跨膜传导调节基因(CTFR)外显子9附近的3′剪切点的TG重复序列结合并导致外显子跳跃，使mRNA转录为不同的蛋白质。TDP-43条件性敲除小鼠与ALS病人大脑中可检测到隐秘外显子的剪切碎片。隐秘外显子可选择性降解包含提前终止翻译密码子的mRNA，当TDP-43功能的缺失时，参与核转入的RANBP1和参与自噬的ATG48的隐秘外显子被剪切，TDP-43被错误定位于核外[17-18]。而TDP-43过表达的脊髓运动神经元中存在神经毒性作用，轴突出现去束化、短截化，轴突的完整性受损[19]，其可能导致运动神经元的退行性改变，并最终导致疾病的发生和进展。最新研究发现，TDP-43的D169G位突变能严重影响TDP-43的分离和核体组装，以致细胞应激时大量TDP-43从核内转移至胞浆，同时D169G突变的TDP-43的运动神经元和果蝇模型中，均表现出较野生型TDP-43更强的细胞毒性和神经退化表型[20]。

2 ALS的潜在治疗药物

利鲁唑是目前唯一的一线用药，被认为能抑制N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)受体和AMPA受体的兴奋性突触后效应，减少谷氨酸释放，降低神经元的兴奋性[21]，有可能延缓病程、延长ALS病人的生存期，但证据尚不明确。除此之外，基于其他靶点的潜在药物仍在研究。

ADAR2条件性敲除小鼠实验证实，通过腺病毒相关(AAV)载体来传递ADAR2基因或口服AMPA受体拮抗剂，可上调ADAR2的表达和GluA2 Q/R位点的RNA编辑，从而减少ADAR2条件性敲除小鼠的运动神经元的凋亡和病理性TDP-43的错误定位。然而目前基因治疗尚无进展，AMPA受体拮抗剂作为ALS的潜在治疗药物存在更多可能。吡仑帕奈是一种新型的AMPA受体拮抗剂，目前已作为抗癫痫药物批准上市，可选择性地减弱Ca2+通过AMPA受体流入，降低AMPA受体对Ca2+的通透性[22]。动物实验证实，给予AR2H和AR2小鼠口服吡仑帕奈14 d，可使运动神经元中的病理性TDP-43正常化，并在90 d后明显阻止AR2小鼠和TDP-43病理相关的运动神经元凋亡进程[10]。目前东京大学已开展吡仑帕奈的临床相关实验，但相关结果尚未发布。