GelMA的合成、表征及在3D生物打印领域的研究进展

夏培斌，余刘洋，王超威，闫立论，刘志远，张 镭，程 杰，崔景强

（1.河南省医用高分子材料技术与应用重点实验室，河南 长垣 453400；2. 河南驼人医疗器械集团有限公司，河南 长垣 453400；3.甘肃省医疗器械检验检测所，甘肃 兰州 730070）

3D生物打印是生物制造、添加剂制造、组织工程和再生医学相结合的产物。使用计算机辅助设计软件，使用机器人计算机辅助制造过程堆叠和组装连续的生物和/或非生物材料层来设计并生产活的3D结构，目的是人工开发活组织和器官的等价物，以用于组织工程、再生医学、药代动力学和生物学的研究[1]。

生物墨水在决定生物制造过程的能力和打印结构的分辨率方面起着关键作用。GelMA具有优异的生物相容性、可调的物理特性以及易于化学或生物修饰的特性，因此成为制造各种组织或器官生物的生物墨水的一个有吸引力的选择。GelMA是一种基于明胶的工程材料，已被证明可用于组织工程、药物输送、细胞培养和3D打印等领域[2]。明胶侧链上的大量氨基可被甲基丙烯酸酐（MA）中的甲基丙烯酰基取代，形成改性明胶，该化学修饰一般只涉及摩尔比不到5%的氨基酸残基，这意味着大多数的功能性氨基酸基序不会受到显著影响。GelMA不仅保持了良好的生物相容性、较低的免疫原性和促进细胞生长的能力，而且在光引发剂的存在下，在紫外光的照射下，具有形成热稳定的三维结构的特性。基于GelMA水凝胶的生物墨水，为3D打印组织器官的研究提供了良好的平台。

本文总结了GelMA水凝胶的合成和性能表征，以及其在3D生物打印组织工程领域的研究及应用进展，以期为GelMA在生物医学3D打印领域的应用提供参考。

1 GelMA水凝胶的合成方法

已经报道的制备GelMA的方法，基本都是在Bulcke等[3]首次报道的方法上进行微小改变后的方法（图1）。合成方法：将明胶加入磷酸盐缓冲液中，50℃下搅拌至完全溶解，然后以一定的速率加入MA，反应3h。混合溶液用 PBS 稀释以停止反应，透析5～7d，以完全去除具有潜在细胞毒性的低分子量杂质。将透析液冷冻干燥后冷藏待用。调节反应物中MA的加入量，可以实现不同程度的甲基丙烯酰基取代。

图1 GelMA的合成原理（A）及水凝胶的制备（B）[4]Fig.1 Schematic of GelMA (A) and the fabrication of its hydrogels (B）

2 GelMA水凝胶的表征

2.1 取代度

取代度是指官能化氨基与原始可用氨基之间的比率。不同的取代度对GelMA水凝胶的物理及生物特性都有显著影响。表征GelMA取代度的方法主要有2种，一种是传统方法即三硝基苯磺酸（TNBS）法，另一种是1H-NMR法。

TNBS法是用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)标记游离氨基的比色法，通过与已知甘氨酸浓度的标准溶液进行比较，从而对游离氨基进行定量。1H-NMR法通过计算改性氨基与原始氨基的峰面积之比，来评估甲基丙烯酰胺改性明胶的取代度。

2.2 相转变温度

GelMA在应用于3D打印组织工程时，相转变温度在打印过程中至关重要。高于相转变温度打印，墨水黏度低，在挤压打印中不成形，只有在低于相转变温度4℃左右时，水凝胶经挤出剪切后，会通过物理交联迅速自愈合，再经紫外光固化即可具有良好的机械性能。

2.3 凝胶孔隙率及孔径

在大多数应用中，水凝胶的基本功能与凝胶内的孔隙大小和孔隙分布有关，材料应满足一定的要求[5]。实际应用中，需要高孔隙率来支持氧气和营养物质向细胞扩散，并从基质中排出代谢废物。此外，孔隙的相互连通性对促进细胞迁移和血管生成等也很重要[6]。水凝胶是由亲水性聚合物在水中或生物液体中膨胀而形成的交联的大分子网络，在植入后，水凝胶孔隙可允许局部血管生成，这是血管化组织的关键要求。因此，控制支架孔隙率和孔径大小在工程组织性能的调控中起着关键作用。

2.4 黏弹性

生物打印技术已被用于生产基于GelMA的具有受控结构的3D构造，从而应用于各种组织工程。在基于挤出的3D生物打印中，应该考虑的重要参数之一是生物墨水的黏度。黏度是生物油墨的基本特性，会影响印刷质量和加工以及细胞活力[7]，对印刷适用性和生物功能有很大影响。通常，用于3D生物打印的聚合物溶液应该具有高黏度和高触变指数，以便在处理后能保持其形状。

2.5 溶胀性

作为3D生物打印组织工程的支架，印刷胶体构造物的相容性在经历冷冻干燥和再膨胀后，不会表现出明显的形态学变化，这为它们的临床可译性提供了新的机会。基于水凝胶的生物材料通常面临与储存性和灭菌相关的挑战，这些挑战可以通过将这些材料加工成冷冻干燥的结构来克服，从而使其能够“现成”应用。

2.6 降解性

不受控制的快速降解是GelMA在生物医学领域面临的主要挑战[8]。组织支架的基本职责，是在整个结构的预期使用寿命内保持细胞增殖和所需的细胞分布。许多情况下，支架的寿命应一直持续到降解完成。因此，在再生医学水凝胶的设计中，一个要考虑的重要因素，是支架在生物降解和愈合过程中的功能依赖性在支架和新生组织之间的转变。

2.7 力学性能

由于不同的自然组织对机械应力的反应不同，理想的植入材料应与目标组织的力学性能密切匹配。作为修复和再生各种器官和组织的材料，GelMA的机械性能的可调性至关重要。基质环境的力学性能已被证明会影响细胞的功能和分化。

3 3D生物打印组织工程的研究进展

组织工程提供了巨大的潜力，以克服器官移植短缺和药物筛选。在研究分子现象时会涉及一些生物功能，如组织形态发生、伤口愈合、炎症反应等。然而，传统的微加工技术无法创建复杂的多尺度结构，如血管内皮与周围结缔组织和薄壁细胞之间的界面[9]等。为了应对这些挑战，生物打印成为一种能够在工程组织构建中创建高度有序的三维血管网络的技术，以促进氧气、营养物质和废物的运输。

3.1 血管

由创伤或疾病引起的血管损伤具有严重的发病和死亡风险。虽然人造血管移植物已成功应用于临床，但它们目前只适用于大直径血管（6mm）。在世界范围内，小直径血管的置换仍然面临着重大的临床挑战。

Zhou等人设计了一种由明胶甲基丙烯酰（Gel-MA）、聚乙二醇二丙烯酸酯、海藻酸盐、裂解酶的VSMCs等组成的新型生物墨水，利用先进的同轴3d生物绘图仪平台，创建了可仿生2种不同的细胞层[血管内皮细胞（VEC）和血管平滑肌细胞（VSMC）]的新型、可调节的小直径血管。分别在血管基质和管腔中，对通常与血管生成现象相关的α-平滑肌肌动蛋白和分化簇31标记物进行染色，结果直观地证实了细胞的增殖，并通过基因分析对结果进行了定量验证，结果表明制备的小直径血管有良好的新生血管表达。

Jia等人[10]报告了一种多功能3D生物打印血管。首先设计了一种特殊细胞响应型的生物墨水，该墨水由GelMA、海藻酸钠及四臂聚（-乙二醇）四丙烯酸酯（PEGTA）组成，与多层同轴挤压系统结合使用，可实现直接3D生物打印。这种混合生物墨水显示出良好的生物学特性，支持被包裹的内皮细胞和干细胞在生物打印结构中的扩散和增殖，可促进生物相关的、高度组织的、可灌注血管的形成。这种新型3D生物打印技术可用于制造可灌注血管，性能优于传统的微制造或牺牲模板方法。

Lee等人[11]提出了一种高度生物相容的重组人弹性蛋白生物墨水，可用于复杂软组织的3D生物打印。该生物墨水由GelMA及甲基丙烯酰胺取代的重组人弹性蛋白（MeTro）组成，可在可见光下交联。两种生物聚合物的协同结合，使得高分辨率打印具有很大的细胞活力，打印的心肌细胞具有内皮屏障功能和心肌细胞的自发性搏动，这是心肌组织在体内的重要功能。此外，在皮下移植大鼠体内的研究中，打印的结构引起最小的炎症反应，并被证明在体内可有效地生物降解。

3.2 仿生器官

随着人口老龄化的加速，移植器官的来源不足已经成为一项亟需解决的社会问题，生物3D打印是解决该问题的最佳途径。在政策与资本的推动下，3D打印技术得到蓬勃发展，但是受限于生物材料技术的发展，生物活性仿生组织器官3D打印技术的发展远远滞后。通过一种快速和直接的方法，发展具有血管网络的工程组织或器官是组织再生的一个重要方向。近几年，大尺寸器官的体外重建及长期功能化培养，成为一个研究重点。总的来说，器官打印及替换是生物3D打印研究的长期目标，需要科研工作者开展进一步的深入研究。

Mao等人[12]设计制造了一种具有内齿轮状结构的新型肝组织，该组织具有更大的体表面积，以促进肝脏功能的恢复。该方法将GelMA与去细胞化的肝细胞外基质（dECM）结合，制备了肝脏特异性生物墨水，并将人诱导的肝细胞（hiHep细胞）封装成负载细胞的生物墨水，采用基于DLP的生物打印技术制备了肝脏显微组织。结果发现在GelMA生物墨水中加入肝脏dECM后，hiHep细胞在肝脏微组织中可扩散得更远，具有更好的肝细胞特异性功能（白蛋白和尿素分泌）。这将是一种潜在的肝组织工程产品，可帮助恢复肝脏功能。

Marie等人[13]利用GelMA水凝胶，混合Huh7和HepaRG这2个肝细胞系，通过开发的三维挤压生物打印过程，打印了一个复杂的肝脏模型。打印的结构显示了长期的生存能力（28d）、增殖能力、相关的肝细胞表型和功能，与使用标准DMSO处理的2D结构性能相当或更好。

3.3 皮肤修复

对于现有的生物打印技术来说，制造适合移植的器官仍然是一个挑战，原因主要是无法再现器官复杂的解剖结构、机械特性和生物功能。全层皮肤缺损的治疗在临床中仍然是一个重大的挑战。三维生物打印技术为制造皮肤替代品提供了一种很有前途的方法。Jin等人[14]成功制备了脱细胞真皮基质（ADM）和GelMA的生物墨水，并提出了一种新的3D结构以模拟天然全层皮肤，其中20%的GelMA以HaCaTs为表皮层，1.5%的ADM以成纤维细胞为真皮层，10%的GelMA mesh以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为血管网络和框架。结果表明，该3D生物打印功能皮肤模型（FSM）不仅能促进细胞的增殖和存活，还能支持体外表皮重建。在体内移植后，FSM可维持细胞活力至少1周。此外，FSM可促进创面愈合和上皮再生，刺激真皮ECM分泌和血管生成，可提高创面愈合质量。

Zhou等人[15]利用新设计的基于GelMA水凝胶的仿生生物墨水，以及基于数字光处理（DLP）的3D打印技术，开发了一种打印功能性活肤（FLS）的新方法。FLS具有相互连接的微通道，可促进细胞的迁移、增殖和新组织的形成。该生物墨水具有快速的凝胶动力学、可调谐的力学性能、良好的生物相容性和组织黏附性。基于DLP的3D打印技术，提供了一种快速精确定位簇状人皮肤成纤维细胞（HSFs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的方法，具有较高的细胞活力，可形成FLS。FLS通过模拟天然皮肤的生理结构，可促进皮肤再生和新生血管的高效形成，并具有较强的机械和生物黏附性能，易于操作和植入创面。体内研究结果表明，活体皮肤具有即时防御功能，在促进大型动物皮肤附肢真皮再生方面具有突出的表现。

4 结语

GelMA以天然高分子明胶为原料，通过化学改性制备。光交联甲基丙烯酰基取代基的引入，使得在光引发剂存在的情况下，GelMA暴露在光照射下时可方便和快速地凝胶化。虽然GelMA水凝胶的研究报道很多，但在临床应用中，保证3D生物打印植入人体后细胞能增殖分化，仍然是一个巨大的挑战。此外，GelMA的明胶来源、合成方法、植入后的安全性评价等，仍没有健全的标准。展望未来，随着研究工作的不断深入，基于GelMA水凝胶的生物材料一定会在3D生物打印领域发挥更大的作用。