响应面法优化酢浆草中α-葡萄糖苷酶抑制成分的提取工艺

朱 斌，郑锦丽，梁 犇，史 娟，郭少波

（陕西省催化基础与应用重点实验室，陕西理工大学化学与环境科学学院，陕西 汉中 723001）

糖尿病是一种临床常见病，2017年的调查显示，中国Ⅱ型糖尿病人约有1.14亿，预测到2035年，该病例数将增加到约5.92亿人次，糖尿病的发病人群逐渐呈现年轻化趋势[1-2]。目前临床针对Ⅱ型糖尿病的治疗方案仍以药物治疗为主，包括胰岛素及类似物、磺酰脲类促泌剂、二甲双胍类、α-葡萄糖苷酶抑制剂等。其中，α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制小肠黏膜刷状缘的α-葡萄糖苷酶，延缓碳水化合物的吸收，从而降低餐后高血糖。目前市场上销售的用于治疗糖尿病的药物阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等均为α-葡萄糖昔酶抑制剂。中医药治疗糖尿病较为经典的名方如肾气丸、六味地黄丸、消渴方、白虎加人参汤等方药沿用至今，近年来对单体如黄连素、民族药如苗药糖宁通络等的研究，受到国际关注[3]。

酢浆草是酢浆草属的一种阔叶草本植物，别称大酸叶草，在我国长江流域及西南分布广泛。现代植物化学和药理学研究发现，酢浆草中含有黄酮类、酚酸类、生物碱类、挥发油等多种化学成分，其药理活性研究主要集中在抑菌、抗肿瘤、抗焦虑、抗癫痫、抗氧化、抗炎镇痛、肝肾保护、促进骨形成等方面[4-5]。Rodriguez等人[6]报道，酢浆草具有一定的降糖作用。本实验以酢浆草提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率为指标，在优化提取溶剂的基础上，通过单因素实验及响应面法，对酢浆草α-葡萄糖苷酶抑制成分的提取工艺进行优化，以期为酢浆草提取物未来应用于临床糖尿病治疗提供一定的参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

酢浆草，α-葡萄糖苷酶，4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-NPG）。磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇、正丁醇、二甲基亚砜（DMSO）(均为分析纯)。自制超纯水。

1.2 主要仪器

KQ2200DE型数控超声波清洗器，DLSB-5/30低温冷却液循环泵，SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，RE-2000A旋转蒸发器，DF-1集热式磁力搅拌器，Cary 5000紫外可见分光光度计。

1.3 实验方法

1.3.1 实验原理

参考文献 [7]的方法，测试酢浆草提取物对α-葡萄糖酶水解p-NPG为4-硝基苯酚的抑制活性，判断酢浆草对α-葡萄糖苷酶的抑制活力，计算方法如式(1)所示：

其中，X=A对照组-A空白组；Y=A实验对照组-A实验组。

1.3.2 原料预处理

酢浆草干燥、粉碎→石油醚脱脂→滤渣烘干待用。

1.3.3 提取溶剂的选择

称取4份（2.0g）经预处理的酢浆草粉末，按液料比20∶1(mL∶g)分别加入超纯水、正丁醇、乙酸乙酯和乙醇，于70℃下提取120 min。提取液按1.3.1的方法进行测试，并计算其对α-葡萄糖苷酶的抑制率，以确定最佳提取溶剂。

1.3.4 单因素实验

以抑制率为指标，考察超声预处理时间、提取时间、提取温度及液料比等因素在不同水平值下，所得的酢浆草提取物对α-葡萄糖苷酶抑制效果的影响。每组进行3次重复实验，取平均值。

1.3.5 响应面法实验因素水平设计

在单因素实验结果的基础上，选取提取时间(A)、超声预处理时间(B)、液料比(C)、提取温度(D)这4个因素作为自变量[8]，编码水平为-1、0、1，各实验因素编码和水平设计见表1。

表1 响应面设计的因素及水平

1.4 酢浆草α-葡萄糖苷酶抑制成分的纯化

将所得的酢浆草α-葡萄糖苷酶抑制成分提取浸膏分为3份，加入相同体积的水之后超声，分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。将有机相减压旋蒸后，用少量中性氧化铝粉末拌匀，烘干，进行硅胶柱层析[9]。所得洗脱液浓缩后分别进行抑制率测定，以确定最优纯化方式。

1.5 酢浆草α-葡萄糖苷酶抑制剂的最佳浓度

将纯化后旋干所得的浸膏加DMSO溶解后，配成1、2、4、6、8、10 mg·mL-1的抑制剂，按1.3.1的方法进行测试，并计算其对α-葡萄糖苷酶的抑制率，以确定最佳抑制浓度。

1.6 数据处理

以上实验均进行3次重复。由Design-Expert 8.0.6软件设计实验并分析，利用Origin软件进行数据处理和作图。

2 结果与分析

2.1 不同提取溶剂降糖效果的比较

分别以石油醚、水、正丁醇、乙酸乙酯、乙醇为溶剂，得到相同提取条件下，不同溶剂提取的酢浆草α-葡萄糖苷酶抑制成分的降糖效果，结果见图1。由图1可知，乙酸乙酯作为提取溶剂时可得到最优的抑制率，故选择乙酸乙酯作为提取溶剂。

图1 不同的提取溶剂对α-葡萄糖苷酶的抑制效果

2.2 单因素实验结果与分析

2.2.1 提取时间对抑制率的影响

5份酢浆草粉末按照30∶1( mL∶g)的液料比加入溶剂中超声预处理10 min后，在70℃下分别提取60、90、120、150、180 min，实验结果如图2所示。提取时间在60～120min内，抑制率逐渐上升；120min时抑制率开始下降，160 min时出现陡降。原因是溶剂进入酢浆草植物细胞，以及细胞内的有效成分传递到溶剂，均需要消耗一定的时间，这有助于α-葡萄糖苷酶抑制成分溶出，使降糖效果提高。但长时间、较高温度的提取，会导致活性物质发生变性、分解，导致抑制率降低[10]，因此最合适的提取时间为120 min。

图2 提取时间对抑制率的影响

2.2.2 超声预处理时间对抑制率的影响

提取温度70℃，提取时间120min，液料比30∶1(mL∶g)，研究超声预处理时间的改变对酢浆草提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的影响，结果见图3。由图3可知，超声预处理时间为10 min时，抑制率达到最大值，继续增加预处理时间，抑制率略有降低。超声预处理加速了植物细胞壁的破裂，有助于酢浆草有效成分的溶出。导致抑制率下降的可能原因，是过长的超声时间导致某些热不稳定组分遭到破坏[8]，因此选择最优超声时间为10min。

图3 超声预处理时间对抑制率的影响

2.2.3 液料比对抑制率的影响

在酢浆草粉末中加入提取溶剂，固定超声预处理时间10min，提取温度70℃，提取时间120min，改变液料比，测试提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率，结果见图4。结果表明，液料比为30∶1 (mL∶g)时有最大的抑制率84.4%。提高液料比可确保药材和提取溶剂有充分的接触面积，从而使有效成分能溶解完全。因此确定最佳液料比为30∶1 (mL∶g)。

图4 液料比对抑制率的影响

2.2.4 温度对抑制率的影响

如图5所示，提取温度在40～70℃时，抑制率呈上升趋势，70℃时抑制率达到最高值80.07%，继续提高温度，抑制率迅速下降。故选择70℃作为最佳提取温度。

图5 温度对抑制率的影响

2.3 响应面法优化分析

将单因素实验结果用Design-Expert 8.0.6软件进行处理，可获得4因素3水平中心组合的29个实验方案，所得的抑制率实验结果如表2所示。

表2 响应面实验设计与结果

2.3.1 方程回归分析和方差分析

用Design-Expert 8.0.6软件对表2的抑制率数据进行数学模型方差分析，分析结果列于表3。以酢浆草α-葡萄糖苷酶抑制成分的抑制率R为因变量，提取时间(A)、超声时间(B)、液料比(C)、提取温度(D)为自变量的二阶多项式回归方程为：

二阶多项式回归方程中的线性项、二次项和相互作用项，体现自变量对响应值的影响[10]，其数值反映各因素对响应值的影响程度，数值越大，则影响越大。回归方程系数为正值则表示各变量对响应的协同效应，为负值则表示反向关系[11]。P值可用于确定模型和系数是否具有统计学意义。由表3的分析结果可知，所选用模型的P＜0.0001且失拟项不显著(P=0.3349＞0.05)，表明模型的可靠性相对较高，也说明回归方程的拟合精度较高。模型的确定系数R2=0.9141，模型的调整确定系数R2Adj=0.8283，说明该模型的实验数据具有较好的拟合度，所以用该模型来描述抑制率与提取条件间的关系较适合，可用于初步分析和预测酢浆草的高效提取工艺参数。由此可知，方程的1次项A、B对响应值的影响极显著，C、D对响应值的影响显著。平方项A2、B2、D2对响应值的影响极为显著，C2对响应值的影响显著。交互项AB极为明显，BD对响应值的作用是显著。各个因素的F值都能够直观反映各个因素受影响的程度和大小，F值越高，其对响应值的影响越大[12]。对各单个因素进行数据分析后发现，FA=12.63，FB=15.36，FC=7.10，FD=5.11。各单因素对酢浆草抗糖抑制率影响的大小顺序为：超声预处理时间＞提取时间＞液料比＞提取温度。

表3 回归模型方差分析

2.3.2 因素交互作用分析

为进一步分析提取时间、超声波时间、液料比、温度对抑制率的影响，固定其中2个变量，得到另外2个因素相互作用的响应面图和等高线图见图6和图7。对比表3可知，提取时间与超声预处理时间、超声预处理时间与温度这2组交互项对响应值的影响显著，其他因素的交互作用对响应值的影响不显著。

图6 超声预处理和提取时间的响应面和等高线

图7 超声预处理和温度的响应面和等高线

2.3.3 最佳工艺条件的确定和验证实验

由Design-Expert 8.0.6程序，模拟得出最佳提取工艺条件为：提取时间135.6 min、超声预处理时间12.12 min、液料比31.93∶1 ( mL∶g)、温度71.61℃，此时抑制率为85.01%。为验证响应面的可信度，结合实际情况，得到酢浆草最佳的提取条件是：液料比30∶1(mL∶g)、超声时间10 min、提取时间120 min、温度70.0 ℃，此时抑制率为84.4%，与推测相符，说明本文采用的优化方案是合理的。

2.4 最佳纯化溶剂的确定

由1.4纯化所得的3种酢浆草α-葡萄糖苷酶抑制成分的降糖抑制率如图8所示，可知正丁醇萃取后的纯化物效果较好。后续实验确定采用正丁醇二次萃取物过柱纯化后的产品。

图 8 不同萃取剂得到的纯化物的抑制率

2.5 最佳测试浓度的确定

从图9可知，酢浆草α-葡萄糖苷酶抑制成分浓度增加所导致的抑制率结果，可分为急速增长区和平缓区。在1～6 mg·mL-1范围内，抑制率从65.9%急速增长至84.6%；在6～10mg·mL-1范围内，抑制率基本维持在82%～83%。从节约成本和确保抑制效果两方面考虑，选择6mg·mL-1为后续实验的抑制剂浓度。

图9 最佳抑制浓度的确定

3 结论

本文以酢浆草为原料，考察了超声预处理时间、提取时间、液料比、提取温度等因素对酢浆草α-葡萄糖苷酶抑制成分降糖效果的影响，采用响应面法优化了酢浆草有效成分的提取工艺。结果表明，影响酢浆草降糖有效成分提取的因素顺序为：超声预处理时间＞提取时间＞液料比＞温度。最佳提取工艺条件为：超声时间10 min、提取时间120 min、液料比30∶1(mL∶g)、提取温度70℃，在此条件下，酢浆草有效成分对α-葡萄糖苷酶的抑制率为84.4%。