LncRNA CASC15通过miR-153-3p/Nrf2反馈环调控胃癌细胞增殖、侵袭和上皮间质转化*

郭 沁，热依拉· 加帕尔，伊尔潘· 库尔班，肖 勇，徐 蓉，苏莎莎

（1.新疆维吾尔自治区第三人民医院消化科，乌鲁木齐 830002；2.新疆维吾尔自治区人民医院肿瘤科，乌鲁木齐 830001；3.新疆医科大学附属中医医院消化内科，乌鲁木齐 830000）

胃癌是第四大常见的癌症，也是全球第二大癌症相关死亡原因。尽管在外科手术和其他治疗方式方面取得了进展，但患者的预后仍然较差[1]。因此，阐明胃癌发生的调控网络，开发新的诊断和靶向治疗的生物标志物是非常必要的。长链非编码RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是一类转录本长度超过200 nt 的非编码RNA[2]，在癌症的发展中具有重要的调控作用，可作为检测癌症的血液生物标志物[3-4]。有文献已经证明LncRNA参与了胃癌进展和肿瘤发生[5]，如LncRNA-PVT1 和FOXM1 的正反馈回路促进胃癌的生长和侵袭[6]。CASC15 是一种保守的LncRNA，已被证明在不同的癌症中发挥了重要的生物学功能。如LncRNA CASC15可通过调控miR-221/ARID1A 轴抑制卵巢癌进展[7]。LncRNA CASC15 通 过 调 控miR-4310/LGR5/Wnt/βcatenin信号通路促进结肠癌细胞增殖和转移[8]。但是，它在胃癌中的作用仍然是未知的。本研究旨在探讨LncRNA CASC15 对胃癌SGC-7901 细胞发展的影响，研究胃癌的发病机制，为患者的治疗提供一个有价值的预后生物标志物和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 样本来源

经本院医学伦理委员会批准，并在患者知情同意下，于2020 年10 月至2021 年4 月在手术后从本院病理科收集了45例胃癌组织和40例癌旁正常组织标本，患者未经过任何放/化疗治疗，其中男26例，女19 例，平均（48.56±6.79）岁，经过病理诊断确诊，标本置于液氮中保存。

1.2 主要材料

胃癌SGC-7901细胞和人正常胃黏膜上皮GES-1细胞来自中国科学院上海细胞库。基质胶来自上海吉至生化科技有限公司。CASC15 siRNA、Nrf2 siRNA等质粒由北京擎科生物公司合成。miR-153-3p 抑制剂（miR-153-3p inhibitor）、miR-153-3p 模拟物（miR-153-3p mimics）来自Genepharma公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 SGC-7901 和GES-1 细胞置于新鲜DMEM 培养基中，加入10%FBS、100 U/mL 青霉素和100 U/mL链霉素，培养皿放置于培养箱中常规培养（37 ℃、5%CO2、饱和湿度），用胰酶分离后传代培养。

1.3.2 细胞转染 SGC-7901细胞接种于12孔培养板中12 h，用无FBS 的DMEM 培养基覆盖细胞，按照Turbofect说明书将质粒分别转染至SGC-7901细胞，培养皿置于培养箱中，实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测转染效率，48 h后收集细胞。

1.3.3 细胞活力测定 质粒转染后的SGC-7901 细胞稀释并接种于96 孔板，设置3 个复孔，放置于培养箱中48 h 后，取浓度为5 mg/mL 的MTT，每孔滴入20 μL，并于4 h后加入DMSO 150 μL，震荡10 min，酶标仪上检测570 nm处的光密度值。

1.3.4 双荧光素酶报告基因活性检测 预测LncRNA CASC15 和miR-153-3p 的靶基因，组 建LncRNA CASC15 wt载体和Nrf2 wt载体，突变后的质粒命名为LncRNA CASC15 mut 和Nrf2 mut。用转染试剂将LncRNA CASC15、Nrf2 野生与突变质粒分别与miR-153-3p mimics、mimics NC 共转染至SGC-7901细胞并检测荧光素酶活性。

1.3.5 细胞侵袭实验 Transwell上室中加入200 μL稀释的Matrigel 基质，静置12 h。SGC-7901 细胞调整密度为1×105个，铺于Transwell上室，下室中加入400 μL DMEM培养基，24 h后用PBS清洗，加入4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色浸染20 min后用显微镜观察并拍照，每样片随机取4个视野计数迁移细胞，计算平均值。

1.3.6 RT-qPCR Trizol 方法提取细胞总RNA，将OD260/280值为1.8－2.0 的RNA 反转为cDNA，得到的cDNA 为模板，参照说明书进行qPCR，每组重复3次，以SYBR Green染料法进行PCR反应，GAPDH和U6为内参基因，采用2-△△CT法计算基因的相对表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.7 Western blotting 实验 提取各组细胞蛋白，BCA 蛋白检测试剂盒测定所提取的蛋白浓度。每孔50 μg 总蛋白进行SDS-PAGE，然后转印到PVDF膜上，用PBST封闭2 h，加入一抗（N-cadherin 1∶1 000；E-cadherin 1∶1 000），置于4 ℃冰箱孵育过夜，TBST洗3 次，二抗（1∶3 000）37 ℃孵育2 h，ECL 化学发光，Bio-Rad凝胶成像系统采集图像，进行灰度值分析，每组实验重复3次。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 软件进行数据分析。实验均独立重复3次，结果以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 下调LncRNA CASC15 抑制SGC-7901 细胞的增殖、侵袭及EMT

RT-qPCR 检测结果显示，胃癌组织中CASC15表达高于癌旁正常组织（P＜0.01），见图1A。SGC-7901 细胞中CASC15 表达高于GES-1 细胞（P＜0.01），见图1B。通过siRNA技术下调了CASC15表达，结果显示，CASC15 siRNA组细胞内CASC15表达低于siRNA NC 组（P＜0.01），见 图1C。将CASC15 siRNA及其siRNA NC转染细胞，进一步分析了细胞增殖、侵袭和EMT 能力，结果显示，CASC15 siRNA 组细胞活力低于siRNA NC 组（P＜0.01），见图1D；与siRNA NC 组比较，CASC15 siRNA组N-cadherin表达降低（P＜0.01），E-cadherin表达上升（P＜0.01），见图1E～图1F。CASC15 siRNA组细胞侵袭数目减少（P＜0.001），见图1G～图1H。表明下调LncRNA CASC15 抑制SGC-7901 细胞增殖、侵袭及EMT。

图1 下调CASC15抑制SGC-7901细胞增殖、侵袭及EMT

2.2 LncRNA CASC15 与miR-153-3p之间的靶向关系

利用miRcode 软件预测发现，CASC15 3’UTR和miR-153-3p 存在结合位点（图2A）。双荧光素酶实验进一步验证发现，与mimics NC+CASC15 wt组比较，CASC15 wt+miR-153-3p mimics 组荧光素酶活性降低（P＜0.01），与mimics NC+CASC15 mut组比较，CASC15 mut+miR-153-3p mimics组荧光素酶活性无明显变化（P＞0.05），见图2B。说明CASC15与miR-153-3p之间具有靶向关系。

图2 LncRNA CASC15与miR-153-3p的靶向关系

2.3 下调miR-153-3p 促进SGC-7901 细胞的增殖、侵袭及EMT

RT-qPCR 检测结果显示，胃癌组织中miR-153-3p 表达低于癌旁正常组织（P＜0.01），见图3A；SGC-7901 细胞中miR-153-3p 表达低于GES-1 细胞（P＜0.01，），见图3B。表明miR-153-3p在胃癌组织和细胞中低表达。下调了miR-153-3p 后发现miR-153-3p inhibitor 组细胞内miR-153-3p 表达低于inhibitor NC 组（P＜0.01），见图3C。将miR-153-3p inhibitor 及inhibitor NC 转染细胞，并分析了细胞增殖、侵袭和EMT 情况，发现miR-153-3p inhibitor 组细胞活力高于inhibitor NC 组（P＜0.05），见图3D；与inhibitor NC 组比较，miR-153-3p inhibitor 组Ecadherin 表达降低（P＜0.01），N-cadherin 表达上升（P＜0.01），见图3E～图3F。miR-153-3p inhibitor 组细胞侵袭数目增加（P＜0.05），见图3G～图3H。说明下调miR-153-3p 促进SGC-7901 细胞增殖、侵袭及EMT。

图3 下调miR-153-3p 促进SGC-7901细胞的增殖、侵袭及EMT

2.4 上 调LncRNA CASC15 通 过miR-153-3p 促 进SGC-7901细胞的增殖、侵袭及EMT

RT-qPCR 检测结果显示，与pcDNA-3.1（+）+mimics NC组比较，pcDNA-CASC15+mimics NC组CASC15表达升高（P＜0.01），miR-153-3p表达降低（P＜0.01），pcDNA-3.1（+）+miR-153-3p mimics 组miR-153-3p表达升高（P＜0.01），CASC15表达降低（P＜0.01）；与pcDNA-3.1（+）+miR-153-3p mimics 组比较，pcDNA-CASC15+miR-153-3p mimics 组CASC15 表达升高（P＜0.01），miR-153-3p 表达降低（P＜0.01），见图4A。分析上调LncRNA CASC15通过miR-153-3p 对SGC-7901 细胞增殖、侵袭及EMT的影响，结果表明，pcDNA-CASC15+mimics NC 组SGC-7901细胞活力高于pcDNA-3.1（+）+mimics NC组（P＜0.05），pcDNA-3.1（+）+miR-153-3p mimics组细胞活力低于pcDNA-3.1（+）+mimics NC 组（P＜0.01），pcDNA-CASC15+miR-153-3p mimics 组细胞活力高于pcDNA-3.1（+）+miR-153-3p mimics 组（P＜0.01），见图4B。分析Western blotting 结果可知，与pcDNA-3.1（+）+mimics NC 组比较，pcDNACASC15+mimics NC 组N-cadherin 表达上升（P＜0.01），E-cadherin 表达下降（P＜0.01），pcDNA-3.1（+）+miR-153-3p mimics 组E-cadherin 表达上升（P＜0.01），N-cadherin 表达下降（P＜0.01）；与pcDNA-3.1（+）+miR-153-3p mimics 组比较，pcDNACASC15+miR-153-3p mimics 组N-cadherin表达上升（P＜0.01），E-cadherin 表达下降（P＜0.01），见图4C～图4D。此外，Transwell 检测结果表明，pcDNACASC15+mimics NC 组细胞侵袭数目高于pcDNA-3.1（+）+mimics NC 组（P＜0.01），pcDNA-3.1（+）+miR-153-3p mimics 组细胞侵袭数目低于pcDNA-3.1（+）+mimics NC 组（P＜0.01），pcDNA-CASC15+miR-153-3p mimics 组细胞侵袭数目高于pcDNA-3.1（+）+miR-153-3p mimics 组（P＜0.01），见图4E～图4F。

图4 上调LncRNA CASC15通过miR-153-3p促进SGC-7901细胞的增殖、侵袭及EMT

2.5 miR-153-3p与Nrf2的靶向关系

用TargetScan 预测发现miR-153-3p 与Nrf2 3’UTR 存在结合位点，见图5A。后续双荧光素酶实验结果分析可知，与mimics NC+Nrf2 wt 组比较，Nrf2 wt+miR-153-3p mimics 组荧光素酶活性降低（P＜0.01）；与mimics NC+Nrf2 mut 组比较，Nrf2 mut+miR-153-3p mimics 组荧光素酶活性无明显变化（P＞0.05），见图5B。说明miR-153-3p 与Nrf2 具有靶向关系。

图5 miR-153-3p与Nrf2的关系

2.6 下调Nrf2对SGC-7901细胞增殖、侵袭及EMT的影响

RT-qPCR检测结果显示，胃癌组织中Nrf2表达高于癌旁正常组织（P＜0.01），见图6A；SGC-7901细胞中Nrf2表达高于GES-1细胞（P＜0.01），见图6B。结果表明，Nrf2在胃癌组织和细胞中高表达。通过siRNA技术下调了Nrf2表达，发现Nrf2 siRNA组细胞内Nrf2 表达低于siRNA NC 组（P＜0.01），见图6C。分别将Nrf2 siRNA 及siRNA NC 对照转染细胞，进一步分析了细胞增殖、侵袭和EMT，结果表明，Nrf2 siRNA 组细胞活力低于siRNA NC 组（P＜0.01），见图6D；与siRNA NC组比较，Nrf2 siRNA组N-cadherin 表达降低（P＜0.01），E-cadherin 表达上升（P＜0.01），见图6E～图6F。细胞侵袭数目减少（P＜0.01），见图6G～图6H。说明下调Nrf2 能够抑制SGC-7901细胞的增殖、侵袭及EMT。

图6 下调Nrf2抑制SGC-7901细胞增殖、侵袭及EMT

2.7 LncRNA CASC15 通过miR-153-3p 上调Nrf2表达

分析CASC15 通过miR-153-3p 对Nrf2 表达的影响，结果显示，CASC15 siRNA+inhibitor NC 组Nrf2 mRNA 和蛋白表达低于siRNA NC+inhibitor NC 组，siRNA NC+miR-153-3p inhibitor 组Nrf2 mRNA 及蛋白表达高于siRNA NC+inhibitor NC 组（P＜0.01）。CASC15 siRNA+miR-153-3p inhibitor组Nrf2 mRNA 及蛋白表达低于siRNA NC+miR-153-3p inhibitor组（P＜0.01），见图7A～图7C。表明LncRNA CASC15通过miR-153-3p上调Nrf2表达。

图7 LncRNA CASC15通过miR-153-3p上调Nrf2表达

3 讨论

越来越多的证据表明，LncRNA 在人类癌症中发挥着越来越重要的作用[9]。在肿瘤发生过程中，LncRNA 已被报道调控转录或转录后调控过程，以及染色质重塑和亚细胞信号通路[10]。CASC15是一种新发现的LncRNA，LncRNA CASC15的高表达是胃癌预后的危险因素[11]。有文献报道LncRNA CASC15通过调控miR4310/LGR5/Wnt/βcatenin 信号通路促进结肠癌转移[12]。LncRNA CASC15 通过调控miR-221/ARID1A 轴抑制卵巢癌进展[7]。本研究发现，CASC15在胃癌细胞和组织中增加，体外实验也证实了敲低CASC15 抑制胃癌细胞增殖、侵袭和EMT（P＜0.05）。由此说明，CASC15可能作为治疗胃癌的一个有价值的预后生物标志物。

大量实验证明了LncRNA 与miRNA 在胃癌中相互影响从而发挥作用。例如，LncRNA PAPAS 通过调控miRNA-188-5p 加重胃癌的进展[13]。在胃癌中，MEG3/miR-21轴通过抑制上皮－间质转化影响细胞流动性[14]。另外还发现LncRNA SNHG16通过miR-135a 发挥致癌基因的作用[15]。为进一步研究LncRNA CASC15 在胃癌肿瘤中发生的深层次机制，通过生物信息学在线工具预测LncRNA CASC15 的下游靶点是miR-153-3p，然后通过荧光素酶报告基因检测进行确认。很明显，LncRNA CASC15 可以作为miR-153-3p 的海绵，且上调LncRNA CASC15 通过miR-153-3p 促进SGC-7901 细胞增殖、侵袭及EMT。另外，发现下调miR-153-3p促进SGC-7901 细胞的增殖、侵袭及EMT。以上论述表明，LncRNA CASC15 通过miR-153-3p 调控胃癌细胞发展。后续进一步研究表明，miR-153-3p靶向且调控Nrf2。越来越多的研究发现，Nrf2的异常表达在肿瘤发展过程中发挥着重要作用。例如，Nrf2 通过调节mRNA 翻译促进胰腺癌的肿瘤维持[16]。NRAL通过miR-340-5p/Nrf2轴介导肝细胞癌顺铂耐药性[17]。实验结果表明，Nrf2 在胃癌组织和细胞中上调，而且siRNA下调Nrf2抑制胃癌细胞增殖、侵袭和EMT，由此说明Nrf2 在胃癌的发病机制中发挥了很重要的作用。

综上所述，CASC15 作为一种致癌基因，通过miR-153-3p/Nrf2轴调控胃癌肿瘤发展。因此，研究CASC15 可能对治疗胃癌有很大的帮助，并成为治疗胃癌的一个潜在新靶点。